不同水平葡萄籽渣对西门塔尔牛体外产气量、发酵参数、营养物质消化率和生长性能的影响

何立荣，马 宁，赵 强，丁保林，吴春苗，许 迟

（宁夏大北农科技实业有限公司，宁夏 银川 750200）

近年来随着人们生态环保意识的不断增强，在退耕还林还草的大趋势下，传统的草食家畜放牧饲养模式正向标准化、规模化的农区养殖转移，因此，对农副产品的需求日渐增加。葡萄酒酿造加工过程中产生的果渣主要是由葡萄皮和葡萄籽渣组成。冯幼等［1］研究发现，葡萄酿酒加工副产物中的葡萄籽渣具有很高的营养价值，含有多种氨基酸和活性物质。葡萄籽渣经加工处理可以作为动物饲料原料。张秀玲等［2］研究发现，将加工处理后的葡萄籽渣应用到畜禽日粮中，不仅可以减少玉米的添加量，还可以提高畜禽的生产性能和经济效益。

非粮型饲料资源的开发是降低畜禽饲养成本、提高经济效益的重要途径。我国非粮型饲料资源数量大、种类多、分布广，将其应用到反刍动物和水产动物日粮中，可节约将近50%的粮食型饲料原料［3］。在反刍动物饲料营养价值评定中常用体外产气法，此方法是基于体外模拟瘤胃内环境，采用饲料样品在瘤胃培养液中发酵所产生气体的比例估计有机物消化率的体外模拟技术，因具有科学、准确、可重复、可批量测定等优点，已被广泛应用到生产［4］。该试验用4%、8%、12%和16%葡萄籽渣替代肉牛精料补充料中部分玉米和棉粕，研究不同水平葡萄籽渣对西门塔尔牛瘤胃培养液发酵参数、营养物质消化率、气体动力学及生长性能的影响，为葡萄籽渣等非粮型饲料原料在肉牛产业化生产中的应用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验日粮组成及营养水平

试验采用单因素试验设计原则，试验日粮参照《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）以及《中国饲料成分及营养价值表》（2019年第30版）配制，用不同水平葡萄籽渣替换部分玉米和棉粕，配伍到肉牛育肥期精料补充料中，试验日粮精粗比为4∶6，粗饲料是由养殖场统一提供的稻草秸秆、玉米秸秆和全株玉米青贮，精料补充料由宁夏大北农科技实业有限公司生产。试验日粮分为对照组（葡萄籽渣添加比例为0）、试验Ⅰ组（葡萄籽渣添加比例为4%）、试验Ⅱ组（葡萄籽渣添加比例为8%）、试验Ⅲ组（葡萄籽渣添加比例为12%）和试验Ⅳ组（葡萄籽渣添加比例为16%）。试验日粮组成及营养水平见表1。

表1 试验日粮组成及营养水平

1.2 体外发酵试验

1.2.1 人工缓冲液的制备

试验所用的体外人工缓冲液按照Menke等［5］使用的方法配制。人工缓冲液由常量元素溶液、微量元素溶液、还原剂溶液、指示剂溶液和缓冲液配制而成。配制好人工缓冲液后立即通入CO2，保证处于厌氧环境，置于39℃恒温水浴中保存备用，同时用磁性搅拌器不断搅拌。人工缓冲液各组分配制方法见表2，人工缓冲液配制各组分体积见表3。

表2 人工缓冲液各组分配制方法

表3 人工缓冲液各组分体积 单位：mL

1.2.2 人工瘤胃培养液的制备

在试验当天清晨于屠宰场选择健康状况良好的西门塔尔肉牛，屠宰后立即取出瘤胃并切开，将瘤胃内容物混合均匀，用4层纱布过滤收集瘤胃液，将现取的瘤胃液置于预热到39℃，并通有CO2的保温瓶中密封后立即带回实验室。将瘤胃液混合均匀后倒入放置在39℃水浴锅中的三角瓶并且持续通入CO2保持厌氧环境。将提前配制的人工缓冲液与瘤胃液以1∶2体积比混合均匀制成人工瘤胃培养液。

1.2.3 样品制备

将每组试验日粮样品制成风干样，粉碎过1 mm筛，称取2 g装入尼龙袋并用封口机封好，每个样品10个重复。

1.2.4 产气量的测定

将美国ANKOMRFS气体测量系统的250 mL产气瓶放入39℃的恒温培养箱预热1 h。取180 mL人工瘤胃培养液置于预热好的产气瓶中，并持续通入CO2，将每组样品取3个重复放入产气瓶，同时另取3个产气瓶加入180 mL人工瘤胃培养液作为产气空白对照，检查并拧紧每个产气瓶瓶盖。将每个产气瓶在（39.0±0.5）℃的空气浴摇床中进行体外发酵72 h。记录并计算发酵0、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72 h的产气体积，减去空白对照发酵瓶产气体积即为产气量。根据马宁等［6］所述的方法计算产气体积。

1.2.5 产气后瘤胃发酵参数的测定

产气试验结束后，取发酵后人工瘤胃培养液测定pH值、菌体蛋白含量、挥发性脂肪酸（VFA）含量和氨态氮（NH3-N）浓度。pH值的测定：采用UB-7型酸度计。挥发性脂肪酸（VFA）的测定：采用气相色谱仪［7］。氨态氮（NH3-N）的测定：取发酵后人工瘤胃培养液10 mL，3 500 r/min离心10 min后，取2 mL上清液置于15 mL试管内，再加入8 mL 0.2 mol/L盐酸摇匀，待测。使用氯化铵作为标准品，用UV-2102PCS型紫外分光光度计测定特定波长条件下的上清液氨态氮浓度［8］。菌体蛋白的测定：菌体蛋白采用考马斯亮蓝法［9］，用752紫外可见分光光度计测定。

1.2.6 营养物质体外消化率的测定

将每组样品取7个重复放入ANKOMDaisyⅡ型自动体外培养箱2.5 L发酵罐，加入1 L人工瘤胃培养液，持续通入CO2，培养48 h后迅速将尼龙袋放入冷水停止发酵，用蒸馏水清洗后放入培养箱，加入1 L酸性胃蛋白酶溶液（1 L 0.1 mol/L盐酸溶液中加入2 g胃蛋白酶）继续发酵48 h，将尼龙袋转移到烘箱中以65℃烘48 h至干燥。根据标准方法测定干物质（GB/T 6435—2014）、粗蛋白（GB/T 6432—1994）、中性洗涤纤维（GB/T 20806—2006）和酸性洗涤纤维（NY/T 1459—2007）的含量，并计算体外消化率。某养分消化率（%）=100×（底物某养分含量-消化残渣某养分含量）/底物某养分含量。

1.3 肉牛育肥试验

1.3.1 试验动物及分组

采用完全随机分组的设计原则，从养殖场同批次牛群中选择体重相近［（214.75±33.96）kg］，健康状况良好、体型、膘情和毛色相近的西门塔尔育肥牛20头，随机分为4组，分别为对照组、试验Ⅰ组（4%葡萄籽渣）、试验Ⅱ组（8%葡萄籽渣）、试验Ⅲ组（12%葡萄籽渣），每组5头。

1.3.2 育肥试验日粮及营养水平

试验选用对照组和含4%、8%和12%葡萄籽渣的精料补充料进行育肥试验，日粮精粗比为4∶6，试验日粮组成同表1。根据标准方法测定育肥试验日粮中粗蛋白（GB/T 6432—2018），中性洗涤纤维（GB/T 20806—2006），酸性洗涤纤维（NY/T 1459—2007），粗灰分（GB/T 6438—2007），盐酸不溶灰分（GB/T 23742—2019），钙（GB/T 13885—2013）和磷（GB/T 6437—2018）含量。育肥试验日粮营养水平实测值见表4。

表4 育肥养殖试验日粮营养水平实测值 单位：%

1.3.3 试验时间与地点

育肥试验于2020年10月17日—12月16日在宁夏贺兰县某肉牛养殖场进行，试验预饲期为10 d，正试期为50 d。

1.3.4 饲养管理

试验前做好每个圈舍的消毒工作，试验牛编号，按照牛场日常管理统一饲喂，每日8：00和16：00各饲喂1次。根据牛体重的增加，逐渐增加投料量，食槽旁另外放干稻草供自由采食，自由饮水。

1.3.5 生长性能指标测定及方法

预饲期结束当天对试验牛称重，为试验初重；正试期结束当天对试验牛称重，为试验末重。计算试验期间总增重和平均日增重。试验期间总增重=试验末重-试验初重；平均日增重=（试验末重-试验初重）/试验天数。

1.4 数据整理与统计分析

试验数据利用Excel 2010进行初步整理，用SPSS24.0统计学软件进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较，试验数据用“平均值±标准差”表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同水平葡萄籽渣对体外产气量的影响

由表5可知，不同水平葡萄籽渣替代精料补充料中等量的玉米和棉粕，进行模拟瘤胃体外发酵后，累计产气量呈递增趋势；在4～36 h各时间点对照组产气量均高于试验组，在36 h后各时间点对照组产气量呈下降趋势，12～24 h各时间点对照组产气量显著（P＜0.05）高于各试验组；72 h总产气量各处理组无显著（P＞0.05）差异，由大到小依次为试验Ⅲ组＞试验Ⅳ组＞试验Ⅰ组＞对照组＞试验Ⅱ组。

表5 不同水平葡萄籽渣对体外产气量的影响

2.2 不同水平葡萄籽渣对体外发酵参数的影响

由表6可知，产气试验结束后各组体外发酵后瘤胃液pH值、NH3-N浓度和菌体蛋白含量无显著（P＞0.05）差异；试验组乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸含量均显著（P＜0.05）高于对照组，但各试验组无显著（P＞0.05）差异。

表6 不同水平葡萄籽渣对体外发酵参数的影响

2.3 不同水平葡萄籽渣对营养物质体外消化率的影响

由表7可知，试验Ⅳ组干物质体外消化率显著（P＜0.05）低于对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅲ组；对照组粗蛋白体外消化率显著（P＜0.05）高于各个试验组，试验Ⅲ组显著（P＜0.05）高于其他3个试验组，试验Ⅱ组最低；对照组和试验Ⅰ组中性洗涤纤维体外消化率显著（P＜0.05）高于其他三组；对照组和试验Ⅲ组酸性洗涤纤维体外消化率显著（P＜0.05）高于其他三组，试验Ⅳ组最低。

表7 不同水平葡萄籽渣对体外消化率的影响 单位：%

2.4 不同水平葡萄籽渣对肉牛生长性能的影响

由表8可知，用4%、8%和12%的葡萄籽渣替代相应比例的玉米和棉粕，配伍到肉牛精料补充料中进行育肥试验。试验结果显示，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组牛的平均日增重显著（P＜0.05）高于试验Ⅲ组；试验Ⅰ组和试验Ⅱ组牛的平均日增重比对照组分别高了170 g/d和140 g/d，但差异不显著（P＞0.05）。

表8 不同水平葡萄籽渣对肉牛生长性能的影响

3 分析与讨论

3.1 不同水平葡萄籽渣替代玉米和棉粕对瘤胃体外发酵产气量的影响

瘤胃发酵的气体主要包括二氧化碳、甲烷、氢气等。哈斯花［10］研究表明，利用体外模拟瘤胃发酵技术，在一定的培养时间内反刍动物瘤胃培养液中微生物对发酵底物的利用程度，可以根据营养成分消化量和产气量进行评估，可以反映瘤胃微生物代谢情况。范小红等［11］研究发现，产气量的大小与营养物质的消化率呈正相关，在体外模拟瘤胃发酵中产气量越高，说明饲粮营养物质消化越充分，可供机体生命活动的能量越多，从而有利于动物的生长。该试验不同水平葡萄籽渣日粮体外发酵72 h产气量随着发酵时间延长呈递增趋势，总产气量各组无显著（P＞0.05）差异；但在不同时间节点产气量呈先上升后下降的趋势，在4～24 h产气量上升最快，原因可能是在发酵初期，样本中大量的可溶性糖和易被微生物利用的成分快速被消化，从而迅速产生大量气体；当发酵24 h后，随着发酵时间的延长单位时间内的产气量慢慢减少，原因可能是底物被不断消化，可发酵成分越来越少，停止发酵。

3.2 不同水平葡萄籽渣替代玉米和棉粕对瘤胃体外发酵参数的影响

pH值是反映反刍动物瘤胃发酵的重要指标，其大小可受发酵底物种类和有机酸沉淀等多种因素影响，高天爽等［12］研究发现，反刍动物消化过程中，瘤胃pH值处于正常范围是保障瘤胃微生物活性、饲料消化利用和瘤胃正常发酵的前提条件；在生理条件下，反刍动物瘤胃液pH值正常变动范围为5.6～7.5。该试验条件下，不同水平葡萄籽渣日粮体外发酵后的pH值均在反刍动物瘤胃液pH值正常范围之内。

在体外发酵体系中，NH3-N是微生物合成菌体蛋白的重要原料。焦光月等［13］研究发现，瘤胃中NH3-N的浓度失衡时，会影响微生物的生长繁殖，只有当瘤胃液中NH3-N浓度最适时，微生物合成菌体蛋白才能顺利进行。该试验5个处理发酵液NH3-N浓度在1.10～1.23 mg/mL，并且添加不同水平葡萄籽渣对NH3-N浓度无明显影响。

反刍动物瘤胃中挥发性脂肪酸（VFA）是通过微生物对碳水化合物的有效发酵而产生，反刍动物生命活动所需的大部分能量是由VFA提供的。黄雅莉等［14］研究发现，在反刍动物体内乳脂主要是由乙酸合成的，体脂主要是由丙酸合成的，乙酸/丙酸值不但受动物采食水平的影响，而且受日粮结构的影响。张世卫等［15］研究表明，随着葡萄籽渣添加量的增加，挥发性脂肪酸浓度和丙酸浓度升高，乙酸/丙酸值下降。在正常情况下，乙酸/丙酸值应大于2.2∶1。该试验结果中，各组乙酸/丙酸值都在正常范围内，在日粮中添加不同水平葡萄籽渣可显著（P＜0.05）提高乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的含量，随着葡萄籽渣添加量的增加VFA浓度升高，这与张世卫等［15］研究结果相符，日粮中加入一定量葡萄籽渣，有利于瘤胃发酵生成能量物质，对牛的生长有利。

3.3 不同水平葡萄籽渣替代玉米和棉粕对营养物质体外消化率的影响

饲料干物质消化率可以反映饲料被消化的难易程度［16］。该试验结果显示，16%葡萄籽渣组干物质体外消化率最低，显著（P＜0.05）低于对照组、4%和12%葡萄籽渣组，表明葡萄籽渣添加量过高不利于饲粮消化；与对照组相比添加不同水平的葡萄籽渣显著（P＜0.05）降低了粗蛋白的体外消化率，可能是饲粮中添加葡萄籽渣不利于瘤胃微生物对饲料中粗蛋白的分解；对照组和4%葡萄籽渣组的中性洗涤纤维体外消化率显著（P＜0.05）高于其他三组，对照组和12%葡萄籽渣组酸性洗涤纤维体外消化率显著（P＜0.05）高于其他三组，表明添加一定量葡萄籽渣不利于反刍动物对纤维的消化吸收。

3.4 不同水平葡萄籽渣替代玉米和棉粕对肉牛生长性能的影响

葡萄籽渣具有丰富的营养物质，粗蛋白质、粗脂肪及碳水化合物的含量高，还含有天然多酚类抗氧化物质。郝小燕等［17］研究结果显示，葡萄籽渣可应用在反刍动物饲料中，可替代一定比例的玉米、豆粕及粗饲料，或作为饲料添加剂使用。在反刍动物养殖过程中应用葡萄籽渣可提高生长性能、繁殖性能、促进营养物质消化，同时具有一定的提高抗氧化能力和改善肉、乳等畜产品品质的作用。Voicu等［18］研究发现，使用20%的干葡萄籽渣等量替代育肥肉牛饲粮中的大麦，不会影响肉牛日增重、采食量、饲料转化效率和牛体健康，且可以显著降低养殖过程中的饲料成本。该试验结果显示，添加4%和8%葡萄籽渣替代肉牛精料补充料中的部分玉米和棉粕，可提高肉牛平均日增重，比对照组肉牛平均日增重分别增加了170 g/d和140 g/d。通过观察发现，试验期间精料补充料中添加8%葡萄籽渣对改善肉牛毛色效果极其明显，使其皮毛更加光亮。

4 结论

在该试验条件下，用4%、8%、12%和16%的葡萄籽渣替代肉牛精料补充料中的部分玉米和棉粕，可以显著提高发酵后瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度，挥发性脂肪酸浓度随着葡萄籽渣添加量的增加而升高。添加4%和8%葡萄籽渣可以提高肉牛日增重。肉牛精料补充料中添加一定量的葡萄籽渣影响粗蛋白和纤维的体外消化率。综上所述，肉牛日粮中添加葡萄籽渣可以促进瘤胃发酵，有利于提高肉牛生长性能。