利用微卫星标记分析兰坪长毛山羊遗传多样性

朱 兰，孙利民，袁跃云，洪琼花，马兴跃*

（1.云南省畜牧兽医科学院，昆明 650224；2.云南省畜牧总站，昆明 650224）

兰坪长毛山羊，又名蓑衣山羊，属肉用山羊品种，分布在云南省兰坪县境内海拔2 500～3 000 m范围的山区及半山区，四肢粗壮结实，耐寒，有较强的适应性，耐粗饲，合群性好，多于夏秋二季发情，双羔率30%左右，屠宰率约为42.5%。兰坪长毛山羊在本地有悠久的饲养历史，当地群众喜用羊皮制作羊皮褂子，有御寒和劳保作用。但长久以来该品种未被重视，没有经过选种选育和提纯复壮，饲养数量较少，将会面临品种资源流失的威胁。

微卫星DNA广泛存在于基因组中，单元长度2～6 bp，串联成簇，被称为短串联重复序列。微卫星具有多态信息丰富、特异性良好、保守性强、检测方法简便快速等特点，利用微卫星标记技术，在进行遗传多样性评价，构建系统发生树，群体遗传结构及亲缘关系分析等研究中有着广泛的应用，是一种可靠的分子标记[1]。Sollero[2]等人用微卫星研究了巴西猪的遗传多样性，Jawasreh[3]研究不同绵羊群体的遗传多样性及群体结构，吕晓阳[4]、汪志国[5]等人用微卫星研究了不同山羊的遗传关系，为山羊遗传育种提供了重要依据，但兰坪长毛山羊的遗传多样性研究未见报道。

本研究从分子水平上利用微卫星标记技术检测兰坪长毛山羊的遗传多样性，分析该品种与10个云南本地山羊群体及波尔山羊群体的遗传关系，由此对兰坪长毛山羊的遗传背景进行科学的评价，为该品种进一步提高选育水平和开发利用提供分子水平的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本

本试验共采集兰坪长毛山羊（CP）血液样品25份。其余11个山羊群体血液样品637份，其中威信白山羊（B）52只，弥勒红骨山羊（HG）62只，龙陵黄山羊（LH）59只，马关无角山羊（MG）60只，圭山山羊（GS）62只，云岭山羊（YL）59只，宁蒗黑头山羊（NL）59只，师宗黑山羊（SZ）60只，昭通山羊（Z）51只，罗平黄山羊（LP）60只，波尔山羊（BE）52只。血液样品采集使用5 mL EDTA-K2真空抗凝采血管，每只实验羊采集3～4 mL，标注编号后保存于-20℃冰箱备用。

1.2 实验试剂

DNA血液提取试剂盒Blood DNA Kit购自Omega Bio-Tek公司，Taq酶、dNTP、10×Buffer购自大连宝生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 微卫星引物

本实验引物参考山羊微卫星相关研究文献[6-9]，通过预实验筛选扩增效果好的14对微卫星引物。引物由上海生物工程有限公司合成，上游引物的5’端用荧光修饰标记（HEX），引物名称、引物序列、扩增片段大小及退火温度如表1所示。

表1 微卫星引物信息

1.4 DNA提取与检测

根据Omega blood DNA kit操作程序从样本血液中提取DNA，获得的DNA溶液保存于-20℃冰箱中。

1.5 PCR扩增及检测

PCR反应体系总量20μL，体系内试剂及其含量如下：10×buffer(Mg2+)2μL，dNTPMixture（2.5 mmoL/L）1.6μL，上、下游引物（1 pmoL/L）各1μL，DNA溶液（10～20 ng/μL）2μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2μL，dH2O 12.2μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，退火30 s（具体退火温度见表1），72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经12%聚丙烯酰胺凝胶初步检测合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行检测。

1.6 统计分析

利用Excel 2010软件整理兰坪长毛山羊等群体微卫星等位基因数据，通过GeneAlex6.01软件[10]计算等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Nei氏遗传距离、基因流（Nm）、遗传变异系数（Fst）、哈迪-温伯格平衡等数据，用CERVUS 3.0软件计算多态信息含量（PIC），用MEGA 7.0[11]构建UPGMA系统聚类图，用Structrue软件[12]构建遗传结构图。

2 结果与分析

2.1 兰坪长毛山羊微卫星位点检测分型

兰坪长毛山羊25个样本14个微卫星位点毛细管荧光电泳检测共获得350个检测结果，显示所有检测结果片段大小符合预期，具有可靠性（见图1）。

图1 BM3033位点毛细管峰电泳分型结果图

2.2 兰坪长毛山羊等位基因多样性

通过对兰坪长毛山羊14个微卫星位点分析，共检测出85个等位基因，平均每个位点6.071个，片段大小在125 bp～265 bp之间，基因频率在0.02～0.82之间（见表2）。

兰坪长毛山羊群体中，14个微卫星位点的有效等位基因数（Na）在3～9之间，最大的位点是OARFCB304和BM6526，最小是BM28。Ne在1.462～6.313之间，最高的位点为OARFCB304，最低为OARRHH55。Ho在0.120～0.760之间，最高位点为MAF65，最低位点为OARRHH55；He为0.316～0.842，最高位点为OARFCB304，最低位点为OARRHH55。I在0.662～1.964之间，最高位点为BM3033，最低位点为BMS574。PIC在0.300～0.822之间，最高位点为OARFCB304，最低位点为OARRHH55，其中位点BM28和OARRHH55PIC值大于0.25小于0.05，其余位点PIC值均大于0.05（见表3）。

14个微卫星位点经哈迪-温伯格平衡检验后发现，BM1329、BM1818、BM6526、BMS1678、BM28、OARAE129、BMS574、MAF65等8个位点偏离不显著，OARFCB304、OARRHH55、BM30333个位点偏离哈-温平衡极显著（P＜0.001），FCB48、BM6404 2个位点偏离非常显著（P＜0.01），MAF0070位点偏离显著（P＜0.05）。

表2 兰坪长毛山羊14个微卫星位点的等位基因片段大小及频率

表3 兰坪长毛山羊14个微卫星位点的遗传变异参数

2.3 群体遗传多样性分析

兰坪长毛山羊与云南10个地方山羊群体以及参考群波尔山羊的遗传多样性进行比较分析，由表2可知，12个山羊群体Na值在5.857～8.643之间，最小的为威信白山羊群体，最大为师宗黑山羊群体，兰坪长毛山羊群体的Na值为6.071；Ne值在3.16～3.791之间，最小的为威信白山羊群体，最大的为师宗黑山羊群体，兰坪长毛山羊群体值为3.323；Ho值在0.543～0.709之间，最小的为兰坪长毛山羊群体，最大的为宁蒗黑头山羊群体；He值在0.629～0.714之间，最小的为威信白山羊群体，最大的为宁蒗黑头山羊群体，兰坪长毛山羊群体为0.658；PIC值在0.581～0.677之间，最小的为威信白山羊群体，最大的为师宗黑山羊群体，兰坪长毛山羊群体为0.618；I值在1.250～1.546之间，最小的威信白山羊群体，最大的为师宗黑山羊群体，兰坪长毛山羊值为1.356（见表4）。

表4 兰坪长毛山羊群体与11个山羊群体遗传多样性比较

续表

2.4 群体间遗传分析

兰坪长毛山羊与波尔山羊群体遗传距离最大，与宁蒗黑头山羊群体距离最小；与宁蒗黑头山羊群体遗传一致度最高，与波尔山羊遗传一致度最低；与宁蒗黑头山羊群体的基因流一致度最高，与波尔山羊间的基因流一致度最低；与波尔山羊间的Fst值一致度最高，与宁蒗黑头山羊群体间的Fst值一致度最低（见表5）。

表5 兰坪长毛山羊与11个山羊群体间的遗传关系分析

根据聚类图（图2）所示，兰坪长毛山羊群体与其它云南省山羊群体距离较远，单独为1支，云南省其它地方群体为一只。波尔山羊单独聚为一支。

图2 12个山羊群体遗传距离UPGMA聚类图

2.5 群体遗传结构

应用STRCTURE软件，通过贝叶斯聚类方法，分析云南省12个地方山羊群体的遗传结构。根据下列公式：

计算ΔK值，并绘制K值对应的ΔK值的变化趋势曲线图，结果可知，当K值为7时，ΔK达到最大（图3），因此推测本研究的所有山羊个体最优分组为7个理论群体（图4）。

图3 基于不同K值假设的LnP（D）值和ΔK值计算结果

图4 在K=7假设下云南省12个山羊群体的遗传结构图

3 讨论

等位基因（Na）是衡量微卫星位点多态性的重要参数，本研究选择的14个微卫星位点，除BM28外，兰坪长毛山羊在各微卫星位点的Na值均在4个以上，平均Na值为6.071，说明所选微卫星位点可用于遗传多样性评估。本实验中Na与Ne的绝对值在0.92～4.024之间，等位基因在该群体中的分布并不均匀，这是由于兰坪长毛山羊受到了地理隔离或者人工选择的影响。哈迪-温伯格定律是指在理想状态下，各等位基因的频率在遗传中保持基因平衡状态。研究发现在兰坪长毛山羊群体中有部分位点不处于哈迪-温伯格平衡状态，可能是在人工选择的过程中造成部分杂合子缺失，一些遗传信息被淘汰而造成哈迪-温伯格平衡偏离的现象。

多态信息含量（PIC）是衡量基因遗传变异程度的重要指标，当PIC＞0.5时，该位点为高度多态性，0.5 >PIC>0.25时为中度多态性，PIC<0.25时为低度多态性[13]。本次研究中选择的14个微卫星位点中，除BM28和OARRHH55属于中度多态位点，其余位点均为高度多态位点。其中OARFCB304的PIC值最高（0.822），提供的遗传信息最多。杂合度的高低与其相关多态信息含量值呈正比，本实验所选择的微卫星位点的平均Ho和He值均大于0.5，群体具有一定的遗传多样性。Fis值反映的是群体内的基因异质化程度，即近交程度。Fis为正值时，表面群体内存在近交；反之，Fis为负值时，群体存在远交[14]。根据研究结果，兰坪长毛山羊的平均Ho值小于He值，Fis为正值，群体存在杂合体缺失，近交和人工选择对群体的遗传多样性有一定影响。

Shannon指数值可以反映群体的遗传变异程度[15]，本次研究的14个位点除BM28外，其余位点I值都大于1，群体总的I值也大于1，说明兰坪长毛山羊虽具有较为丰富的遗传多样性，但该群体可能受人工育种的影响较云南省其余山羊群体更大。

通过与云南省其它山羊群体的遗传多样性比较发现，兰坪长毛山羊的Na、Ne、He、I、PIC值仅高于威信白山羊，低于其余11个群体，Ho值甚至低于威信白山羊，说明该品种的遗传多样性在云南省的地方山羊群体中并不高。本实验的群体遗传多样性参数与国内其它研究结果略有差异。张爱玲[16]等人利用微卫星分析6个山羊品种的遗传多样性，平均PIC值在0.6859～0.7083之间；张娜娜[17，18]利用微卫星分析伏牛白山羊的遗传多样性，平均PIC值为0.789，太行山黑山羊的平均PIC值为0.781。本实验中12个山羊群体的平均PIC值在0.581～0.677之间，均大于0.5，群体具有较强的遗传多样性，与上述学者研究结果相比多态信息含量略低，但比吕晓阳（2016）等人的对2个山羊品种的遗传多样性研究结果略高（平均PIC值0.3110～0.4115），与赵艳红[19]等人对中国6个山羊群体的遗传多样性研究结果接近（平均PIC值0.533～0.639）。本实验中云岭黑山羊的平均PIC值为0.613，低于贾小姣[20]、兰蓉[21]、武志娟（2013）等人的研究结果（PIC值0.6856～0.865）；参考群体波尔山羊PIC值为0.644，比凌英会[22]、李国红[23]等人的研究结果也略低（PIC值0.671～0.766）。这一方面与所采集样本的群体不同有关，另一方可能是本次实验选用的微卫星位点与其他研究不同造成的。

Fst值用于衡量群体间的遗传分化程度。根据Wright[24]的研究结果，Fst值在0.15～0.25之间的时候，群体间为高度分化。兰坪长毛山羊与云南省其它山羊群体间的Fst值均超过0.15，群体高度分化，具有明显独立的品种特征。Wright认为，群体间的Nm数值大于1时，能够抑制遗传漂变引起的群体间遗传分化；反之，当Nm数值＜1时，表明基因交流较小，群体有可能受遗传漂变影响从而走向分化。兰坪长毛山羊与其它群体的基因流均大于1，这其中与宁蒗黑头山羊的基因交流一致度最大，这与两个山羊群体所在的地理位置相对靠近的实际情况相符合。Nei氏遗传距离和遗传一致度的计算结果也显示出，兰坪长毛山羊与宁蒗黑头山羊之间具有更为接近的遗传距离和更高的一致度。根据聚类图分析，兰坪长毛山羊与波尔山羊群体分化明显，说明本次试验以波尔山羊作为参照群所取得的数据较为可靠，符合生产育种背景。兰坪长毛山羊与云南省其它山羊群体分为独立的两个分支，表明其与云南省地方山羊群体的亲缘关系较远，有相对独立的遗传背景。通过STRUCTURE软件分析所有山羊群体，发现云南省13个山羊群体划分为7个理论群，其中兰坪长毛山羊、波尔山羊两个品种颜色相对独立，威信白山羊、龙陵黄山羊、罗平黄山羊、宁蒗黑头山羊、师宗黑山羊、云岭山羊、昭通山羊的群体相互之间有颜色交叉的情况，圭山山羊、弥勒红骨山羊、马关无角山羊三个群体的遗传背景基本相近，这与聚类分析的结果类似。

4 结 论

本研究选取的14个微卫星位点可用于兰坪长毛山羊的遗传多样性评估，结果表明，兰坪长毛山羊具有一定的遗传多样性和相对独立的品种特征、地理隔离和人工选择对群体遗传结构丰富程度有一定负面影响，因此，需加强兰坪长毛山羊品种保护，适当扩大群体结构，以丰富品种内的遗传结构，提高种群的内在活力。研究结果为正确评估兰坪长毛山羊的品种价值，以及今后制定合理可行的保种方案提供分子水平的遗传学依据。