绵羊肺炎支原体云南分离株鉴定及其TU/HSP70 基因特征分析

汤琳波，李富祥，邵庆勇，王金萍，樊月圆，高华峰

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650224；2.云南农业大学，云南昆明 662400）

羊传染性胸膜肺炎主要是由丝状支原体山羊亚种（Mmc）、绵羊肺炎支原体（Movi）、山羊支原体山羊亚种（Mcc）和山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）等引起的在山羊或绵羊中普遍流行的接触性传染病[1-4]。该病在云南省冬春两季最为常见，以发热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺间质性肺炎为主要病变特征。羊群感染后发病率较高，病程也较长，因此其对养羊业造成了严重危害。

由于羊传染性胸膜肺炎的病原复杂，存在多种病原体，不同支原体及亚种致病性及毒力也存在较大差异。因此，加强病原监测是控制本病的重要环节。对山羊传染性胸膜肺炎病原监测表明，Mmc 和Movi 是感染山羊的两种优势支原体株，其中Mmc 检出率较低，但致病性更强，Movi 检出率较高，但感染后症状表现较轻[3]。伴随着分子生物学和基因工程技术发展，关于羊传染性胸膜肺炎在分子水平上的研究取得了长足进展。研究[5-7]发现，Movi 16S rRNA 序列相似性较高，不同株同源性可达99.3%～99.9%，因此基于该基因的PCR 快速检测方法能很好地完成病原检测[7-9]。目前借助分子生物学技术，对病原检测的方法已较为完善。但基于血清学方法对本病检测及免疫评估仍缺乏相应手段。现有研究[10]表明，Movi 热休克蛋白（HSP70）及延伸因子（TU）具有较好的抗原性。2020 年冬季，本课题组从云南省昆明市某山羊养殖场分离到一株Movi，在完成形态学及16S rRNA 比对分析的基础上，系统研究分析了TU和HSP70两种基因序列特征及抗原特性，以期为了解云南省Movi 病原学特征提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 2020 年冬季，由于气候变化波动较大，云南省昆明市某山羊养殖场部分羊群发病。病羊初期表现为精神沉郁、食欲不振、被毛粗乱无光、有黏液性化脓性眼鼻分泌物、呼吸急促，羊群自然发病率为30%左右，但死亡率较低。从不同发病时期采集病羊鼻分泌物、死亡羊肺脏、扁桃体组织及胸腔积液，用于病原分离培养，同时采集康复期羊血清。

1.1.2 主要培养基 支原体琼脂基础培养基CM0410B、支原体肉汤基础培养基CM0403B 及补充培养基SR0059C，均购自赛默飞公司，参照使用说明书配制使用。

1.1.3 主要试剂 原核表达载体pET-28a、大肠杆菌DH5α 菌株、大肠杆菌BL21 菌株，由本实验室保存；2×PremixTaq、限制性内切酶、DNA连接酶、pMD18-T 载体、质粒提取试剂盒、细菌基因组DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒及DNA Marker 等分子生物学试剂，购自大连宝生物公司；IPTG 及蛋白Marker，购自Sigma 公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，购自北京索莱宝公司；引物合成及测序，由昆明硕擎生物技术有限公司完成。

1.1.4 样品DNA 提取 参照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书，提取样品及纯培养物DNA 后于-20 ℃保存备用。

1.2 病羊临床症状及病理剖检观察

观察记录羊发病过程临床表现，并对死亡羊只进行常规剖检。

1.3 支原体分离纯化

扁桃体及肺脏组织用含青霉素的双蒸水清洗后研磨，再加入2 mL 液体筛选培养基增菌，2 000 r/min 离心5 min；取上清液接种至固体培养基，将固体培养基置于37 ℃ 5% CO2培养箱中继续培养5 d；挑取单菌落接种于液体培养基上进行培养，得到纯培养物。

1.4 支原体样品16S rRNA 检测及鉴定

使用细菌基因组提取试剂盒分别提取分泌物、组织样品及分离纯培养物的基因组DNA，根据参考文献[5]合成Movi 及Mmc 16S rRNA 检测引物（表1）。用上述引物对提取的基因组DNA 同时进行PCR 扩增，反应体系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分别为0.5 μL，模板2.0 μL，最后用灭菌蒸馏水补足至25.0 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共进行35 个循环；72 ℃延伸7 min。PCR 反应产物经胶回收纯化后，送昆明硕擎生物技术有限公司测序，将所得序列与GenBank中16S rRNA 序列进行比对验证。

表1 Movi 及Mmc 16S rRNA 扩增引物信息

1.5 Movi HSP70 及TU 基因PCR 鉴定

分别设计2 对扩增全长HSP70及TU基因序列的特异性引物（表2）。以病原分离培养中纯培养的支原体基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增。反应体系（25.0 μL）：PremixTaq12.5 μL，上下游引物分别为1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用灭菌蒸馏水补足至25.0 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共进行35 个循环；72 ℃延伸7 min。PCR 反应产物经胶回收纯化后，连接克隆载体pMD18-T，完成阳性鉴定后送昆明硕擎生物技术有限公司测序。将所得序列与GenBank 中参考序列进行比对，并采用邻接法（Neighbor Joining method，NJ法）构建系统发育树。

表2 HSP70 及TU 基因扩增引物信息

1.6 HSP70 及TU 基因生物信息学分析

将克隆所得HSP70及TU基因测序验证结果，与GenBank 收录的支原体序列完成比对，利用MEGAX 软件构建NJ 进化树，分析Movi 分离株与其他株的亲源关系，并利用DNAstar 软件分析不同支原体序列核苷酸的同源性。

1.7 表达载体构建及HSP70 及TU 蛋白诱导表达

对测序正确的克隆载体和表达质粒pET-28a分别进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切，目的片段和载体胶回收后用T4 DNA 连接酶置于16 ℃过夜连接；将连接产物转化至DH5α 感受态细胞，克隆经PCR测序验证后提取质粒转化BL21 感受态细胞；将阳性单克隆接种LB 培养基，在OD600达到约0.6 时加入1 mol/L IPTG 诱导6 h，以12 000 r/min 离心5 min 收集表达菌体沉淀及上清。

1.8 蛋白染色及Western blot 分析

取40 μL 表达上清及经超声波裂解后的菌体，加入10 μL 5×SDS-PAGE loading Buffer 煮沸10 min并置于冰上，12 000 r/min 短暂离心后，取10 μL样品进行SDS-PAGE 电泳；弃去浓缩胶，将分离胶放入考马斯亮兰染色液中过夜染色，煮沸脱色后完成凝胶成像。将完成电泳的样品同时转移到硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶封闭后加入康复期绵羊血清4 ℃孵育过夜，用PBST 洗净，加入按1:2 000 比例稀释后兔抗羊过氧化物酶标记IgG，孵育1 h 后PBST 清洗，加入显色底物完成显色。

2 结果

2.1 临床症状

该场羊只病例呈散发性，表现为冬季温差较大时易发病，病程较长，发病率较高，但死亡率较低，以咳嗽、精神沉郁、食欲不振、被毛粗乱、眼结膜潮红、有黏液性化脓性眼鼻分泌物为主要症状。随着病情加重，全群采食量下降，羊群自然发病率约为30%。治疗后死亡病例少。剖检病死羊发现，呼吸道及肺部出现典型病理变化，剖检可见扁桃体肿大、化脓并充血，病程加长后鼻甲骨变形为典型症状，肺局部发生肉变，胸腔有少许红色积液及黄色分泌物（图1）。

2.2 支原体分离

将纯化培养后的分离株接种至固体培养基，在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养3～5 d 后，可观察到灰白色针尖状大小菌落。挑取针尖状培养物完成纯培养，低倍显微镜下观察菌落形态，菌落呈“煎蛋样”形态（图2）。

2.3 16S rRNA PCR 鉴定及HSP70、TU 基因克隆

分离株纯化后，将2 个单菌落分别接种于液体培养基进行增菌培养；提取支原体基因组DNA，经两对16S rRNA 通用引物扩增后获得与预期相符的条带，其大小为563 bp，二重PCR 未见Mmc 阳性扩增（图3-A）；扩增条带样品测序后，经BLAST 分析比对确定为Movi，并将其命名为YN-2020 株。完成阳性鉴定的单菌落经HSP70及TU基因全长引物扩增，结果显示，TU基因扩增大小为1 209 bp，HSP70基因扩增大小为1 818 bp，均与预期大小相符（图3-B、C）。

2.4 YN-2020 分离株遗传进化分析

Movi 分离株YN-2020TU基因全长经PCR 扩增后，产物与克隆载体pMD18-T 连接转化，涂板后经PCR 完成阳性克隆筛选，测序验证确定序列信息。根据TU基因序列与GenBank 初步比对结果，从中选取具有代表性的14 株支原体序列构建遗传进化树，并完成核苷酸序列比对。遗传进化分析结果显示：Movi 分离株YN-2020TU基因与Movi MoGH3-3 株亲缘关系较近，与Movi 标准株Y98 亲缘关系较远；在不同支原体种间，YN-2020TU基因与牛殊异支原体（Dispar）亲缘关系较近，与禽滑液囊支原体（Synoviae）亲缘关系较远（图4-A）。核苷酸序列比对结果显示，其与Movi MoGH3-3 株同源性最高（98.2%），与发酵支原体（Fermentans）PG18 株同源性最低（72.8%）。

Movi 分离株YN-2020HSP70基因全长经PCR 扩增后，产物与克隆载体pMD18-T 连接转化，涂板后经PCR 完成阳性克隆筛选，测序验证确定序列信息。根据HSP70基因序列与GenBank初步比对结果，从中选取具有代表性的15 株支原体序列构建遗传进化树，并完成核苷酸序列比对。遗传进化分析结果显示：Movi YN-2020 分离株HSP70基因与Movi 117 株亲缘关系较近，与Movi NCTC10151 亲缘关系较远；在不同支原体种间，YN-2020HSP70基因与Dispar亲缘关系较近，与猪鼻支原体（Hyorhinis）亲缘关系较远（图4-B）。核苷酸序列比对结果显示，其与Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），与HyorhinisHub-1 株同源性最低（80.1%）。

2.5 YN-2020 分离株TU 及HSP70 蛋白诱导及表达

对含有目的基因的重组质粒和空表达载体pET-28a 双酶切后，以T4 DNA 连接酶连接，将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）中完成表达克隆载体构建，并将其分别命名为pET28a-rTU及pET28a-rHSP70。两种重组菌落分别于20 ℃培养16 h 及37 ℃培养6 h（两种蛋白均使用两种温度条件进行诱导表达），诱导后分别收集菌体沉淀及上清，菌体经超声破碎后，取样进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹检测。染色结果显示：表达载体pET28a-rTU 在20 ℃培养16 h 及37 ℃培养6 h 均能较高量表达TU 蛋白，诱导后TU 蛋白在上清中表达量低，在菌体沉淀中表达量高，重组蛋白大小约48.0 kDa，与预期大小一致（图5-A、B）；表达载体pET28a-rHSP70 在20 ℃培养16 h 及37 ℃培养6 h 均能表达HSP70 蛋白，但在20 ℃诱导培养16 h 获得的重组蛋白表达量较高，且在上清及菌体沉淀中均有表达，重组蛋白大小约68.0 kDa，与预期大小一致（图6-A、B）。

3 讨论

传染性胸膜肺炎是由不同支原体引起的一类重要山羊和绵羊传染病。该病广泛分布于世界各主要山羊及绵羊养殖地区，尤其是亚洲和非洲国家。病原学和血清流行病学研究[1-3]表明，不同国家和地区羊群中流行的羊群感染支原体优势菌株存在较大差异。近年来，由支原体感染引起的传染性胸膜肺炎在我国呈现增多趋势，不同地区流行的羊传染性胸膜肺炎主要由Movi 和Mmc 引起，两种支原体的混合感染给疾病防控带来了困难[1-5]。云南省病原监测表明，这两种支原体是最常见的优势菌种。流行病学监测发现：Mmc 检出率低但致死率高；Movi 检出率较高，部分未引起发病的羊场也能通过PCR 检出，一旦有应激因素如气候激烈变化或发生基础性疾病，就可能引发局部流行。单纯由Movi 引起的羊群死亡率较低，多数病例伴随细菌（如巴氏杆菌及链球菌）继发感染，给本病防治增加了困难。

Movi 在云南省羊群中较高的阳性率以及带来的防治成本增加，制约了肉羊养殖效益提高，因此需要强化病原学研究。本研究中，结合云南省部分羊场支原体病原监测工作，采集病料完成了病理剖检及病原检测。病理剖检表明，本次羊场羊只呼吸道感染疾病由Movi 引起，主要症状表现为扁桃体肿大及慢性肺炎。在上述工作的基础上，完成了病原分离鉴定，并对YN-2020 分离株部分抗原基因进行了基因特征及蛋白表达研究。遗传进化树分析表明，分离株YN-2020TU及HSP70基因均存在一定程度变异，在与国内外流行株比较中，TU基因与Movi MoGH3-3株核苷酸同源性最高（98.2%），与FermentansPG18 株同源性最低（72.8%）。HSP70基因则与Movi 117 株核苷酸同源性最高（99.4%），与HyorhinisHub-1 株核苷酸同源性最低（80.1%）。YN-2020 分离株与其他代表株相比，核苷酸同源性较高，两种基因均较为保守，其中HSP70基因保守性高于TU基因。此外，两种蛋白抗原性分析表明，两种蛋白在Western blot 检测中均与康复期绵羊血清有反应性，提示表达蛋白具有良好的免疫原性。对两种蛋白的结构与功能仍需加深研究，以期指导未来生产实践。