高分子量壳聚糖及其混剂对货架期葡萄的保鲜效果

高凤菊

（唐山师范学院生命科学系，河北 唐山 063000）

巨峰葡萄（Vitis vinifera cv.Kyoho），风味独特，品质优良，是我国鲜食葡萄的主要栽培品种[1]。由于其组织软嫩、水分含量高，在货架期易发生腐烂变质、脱粒干梗等现象，给生产者和销售者造成巨大的经济损失[2]，因此对新型高效环保的葡萄保鲜剂的研究和开发非常重要。

目前市售保鲜剂多为化学保鲜剂，如扑海因（异菌脲）、甲基托布津、多菌灵、苯来特、仲丁胺、二氧化硫等，这些保鲜剂虽有较好的防腐保鲜效果，但其残留物会对人体健康造成不良影响，且后期处理也会对环境造成污染[3]。

壳聚糖是甲壳素脱去部分乙酰基的氨基多糖[4]，是目前自然界中唯一发现带正电荷的食物纤维[5]，其来源丰富，价格低廉，且壳聚糖具有无毒，无刺激，无热源反应，可自然降解及较强的抑菌效果等诸多特点，是一种安全的绿色食品保鲜剂[6]。目前，壳聚糖及其衍生物涂膜在荔枝、山楂、马铃薯等多种果蔬的保鲜试验中已取得令人满意的效果[7]。

壳聚糖应用于葡萄的保鲜也有许多研究，但多集中在单一分子量壳聚糖或衍生物单独或与其他物质复配的使用[6,8]。关于不同分子量壳聚糖混合保鲜效果的研究很少，吴湛霞等[9]研究发现，不同分子量的壳聚糖按照一定比例混合，较单一分子量壳聚糖对罗非鱼的保鲜效果显著提高。但将不同分子量壳聚糖按特定比例混合后的保鲜效果在果蔬保鲜方面的研究几近空白。本试验以新鲜巨峰葡萄为材料，研究了室温下利用4种高分子量的壳聚糖及其等比例混剂涂膜处理对葡萄货架期保鲜效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

巨峰葡萄：采收时间为2020年9月上旬，于当日上午采摘，采摘后不进行任何保鲜处理，常温运输3 h内抵达试验地点；壳聚糖（脱乙酰度90%，相对分子量分别为50、150、250、500 kDa）：购于浙江澳兴生物科技有限公司）；抗坏血酸、2,6-二氯酚靛酚、三氯乙酸等试剂均为分析纯；试验用水为蒸馏水。

1.1.2 仪器与设备

WYIA型阿贝折射仪，贵阳新天光电科技有限公司；YP6102电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；BCD-196T冰箱，青岛海尔股份有限公司；722 s可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；TDL-60B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-S8恒温水浴锅，金坛市医疗仪器厂；DHDK-98II型电子万用炉，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 单一壳聚糖及其等比例混剂涂膜液的制备

称取30 g抗坏血酸，用蒸馏水定容至1 L。分别称取相对分子量为50、150、250、500 kDa的壳聚糖各10 g。用30 g/L抗坏血酸溶液配制终浓度为10 g/L相对分子量分别为50 kDa（处理1）、150 kDa（处理2）、250 kDa（处理3）和500 kDa（处理4）的高分子量壳聚糖涂膜液。将4种高分子量壳聚糖涂膜液按1∶1∶1∶1混匀，配制混剂涂膜液（处理5），在混剂涂膜液中，不同高分子量壳聚糖终浓度为2.5 g/L。

1.2.2 涂膜处理

选取无机械损伤，大小均一，颜色一致，紧密度相似，熟度相当的葡萄串清洗晾干后，浸入配制好的相应涂膜液中1 min（每个处理进行3次重复，每次重复使用8 kg葡萄），取出晾干后室温（25℃）下贮藏，每24 h取样，测定失重率、VC含量、可滴定酸含量、呼吸强度、花青素含量、可溶性固形物含量和丙二醛含量，连续测9 d，以蒸馏水代替壳聚糖涂膜液作为对照（CK）。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 感官评价

通过感官评价等级对各个试验组进行评级。感官评价等级参照文献[10]分为6个等级，5级：表面光滑，未变色或几乎未变色，果粒、果柄坚实，果柄与果粒连接紧密；4级：表面失去光泽，颜色变黑红，果粒开始变软，果柄失去光泽；3级：表面无光泽，有擦伤，擦伤处变白，果粒软化，果柄萎缩出现褐斑，果粒开始脱落；2级：表面黑红，轻微发霉，出现霉斑，果粒软化严重，果柄干枯；1级：霉斑数量增多，面积增大，果粒软化严重、脱落，果柄干枯；0级：果粒表面严重发霉，皱缩，果柄干枯。3～5级为有商品价值，可食用，0～2级为没有商品价值，不建议食用。

1.2.3.2 失重率

采用称量法[11]进行测定。

1.2.3.3 可溶性固形物含量

使用手持测糖仪[12]测定。

1.2.3.4 花青素含量

采用比色法[11]进行测定。

1.2.3.5 丙二醛（MDA）含量

采用硫代巴比妥酸法[11]进行测定。

1.2.3.6 呼吸强度

采用小篮子法[13]进行测定。

1.2.3.7 可滴定酸含量

采用酸碱滴定法[11]进行测定。

1.2.3.8 VC含量

采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[14]进行测定。

1.2.4 数据处理

采用Excel及LSD数据处理系统进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄感官品质的影响

对于货架期葡萄，其感官评价对销售具有直接影响，是评价保鲜效果的重要指标。由表1可知，随着葡萄货架条件下存放时间的延长，感官等级逐渐下降，各壳聚糖处理组的感官等级均优于对照组。所有试验组在贮藏初期均果粒饱满，质地坚挺。对照组货架期3 d后，果实外表已出现变色，皱缩，果肉软化程度严重，基本失去了商品价值；贮藏5 d后，果实几乎全部软烂变质，完全失去了食用价值。这是由于在没有外界保鲜剂干预的情况下，随着货架期时间的延长，葡萄果肉细胞的细胞壁中非水溶性原果胶很快被分解成水溶性果胶，细胞壁软化，结构被破坏，果实外表皱缩，组织形态软化，当果胶进一步转化为果胶酸时，葡萄果肉彻底软烂。此外，在果实成熟衰老过程中，果肉的抗菌能力逐渐下降，而随着果柄脱水，果粒与果柄发生脱离，更易受到微生物侵染，从而加快果实软烂变质的进程。不同壳聚糖处理组均能够有效地维持细胞壁的结构和功能，增强果实硬度，降低乙烯生成量，保持细胞膜的完整性，同时又激活了果实内某些酶诱导合成植保素，而植保素可以使葡萄更好地抵御病原微生物的侵害，因而壳聚糖涂膜处理可以较好地延缓货架期葡萄感官品质的下降。

表1 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄感官评价等级的影响Table 1 Effects of different chitosan coating treatments on sensory evaluation grades of grapes

2.2 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄失重率的影响

货架期间，葡萄果实的失重主要是由呼吸和蒸腾作用引起，包括水分和干物质的损失，蒸腾失水为主要因素，约占总失重的80%[15]。由图1可知，单一壳聚糖处理时，随着货架时间的增加，失重率呈上升趋势。其中相对分子量为50 kDa的壳聚糖处理组失重率和失重率的增幅显著低于其他单一壳聚糖处理组（P＜0.05），与壳聚糖混剂处理组的变化趋势相似。由上推测，在混剂中相对分子量为50 kDa的壳聚糖起主要作用。

图1 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄失重率的影响Fig.1 Effects of different chitosan coating treatments on weight loss rates of grapes

货架期前5天，各试验组失重率都较低，且增速较缓，对照组失重率增速最高，从开始的0.53%增长到1.76%，第5天后急剧上升，失重率从1.76%迅速上升到第9天的4.59%。在9 d货架期内，所有壳聚糖处理组失重率增速均较缓，第6天时，壳聚糖混剂处理组失重率为0.94%，与对照组的2.39%存在极显著差异（P＜0.01），且与相对分子量为50、500 kDa壳聚糖处理组（失重率分别为1.57%、1.89%）存在显著差异（P＜0.05）。壳聚糖混剂处理组在整个贮藏期间失重率的上升幅度最小，在2～7 d内失重率维持在0.80%左右，第8天时才迅速上升到2.14%，第9天时为3.05%。随着货架期时间的延长，对照组失重率和代表失重率增速的曲线斜率始终高于壳聚糖处理组，而壳聚糖混剂处理组的失重率和失重率增速在贮藏期间始终低于其他处理组，由此得出结论，壳聚糖混剂处理对葡萄的保鲜作用在降低货架期葡萄失重率方面效果最好。另外，货架期7 d后，所有壳聚糖处理组的失重率均急剧上升，说明高分子量壳聚糖涂膜处理的有效期为7 d。

2.3 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄可溶性固形物含量的影响

可溶性固形物含量是衡量葡萄商品品质及货架期品质的重要指标之一[16]。由图2可见，随着货架期时间的延长，所有试验组葡萄的可溶性固形物含量均下降。对照组下降幅度最大，从第1天的16.34%下降到第9天的10.10%，下降了6.24个百分点，壳聚糖混剂涂膜处理后，葡萄可溶性固形物含量变化幅度最小，仅下降了2.25个百分点，与对照存在极显著差异（P＜0.01）；在单一壳聚糖处理组中，相对分子量为150 kDa和250 kDa壳聚糖处理组（可溶性固形物含量分别下降了4.44和4.00个百分点）的降幅最小，与对照组存在显著差异（P＜0.05），单一壳聚糖处理组平均下降了4.67个百分点，而壳聚糖混剂处理组下降了2.25个百分点，显著低于单一壳聚糖处理组，所以壳聚糖混剂涂膜处理延缓葡萄可溶性固形物含量的降低效果最好。相对分子量为150 kDa和250 kDa的壳聚糖处理组的可溶性固形物含量下降趋势与等比例壳聚糖混剂处理组相似，平均下降4.22个百分点，显著低于分子量为50 kDa和500 kDa壳聚糖（平均下降5.11个百分点）（P＜0.05），说明中等的高分子量壳聚糖涂膜处理对葡萄可溶性固形物含量下降的缓解作用较明显。

图2 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄可溶性固形物含量的影响Fig.2 Effects of different chitosan coating treatments on soluble solids contents of grapes

2.4 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄花青素含量的影响

花青素为植物二级代谢产物，在生理上扮演重要角色，低温、缺氧和缺磷等不良环境也会促进花青素的形成与积累[17]，花青素含量预示着细胞衰老程度。从图3可以看出，不同壳聚糖处理组均可在一定程度上抑制花青素含量的上升，壳聚糖混剂处理组花青素含量上升最慢，第5天时仅增长了46%，而相对分子量为150 kDa的壳聚糖处理组花青素含量增长了62%，增长值仅次于壳聚糖混剂处理组。壳聚糖混剂处理组的花青素含量增长值与其他试验组的增长值均存在极显著差异（P＜0.01），故壳聚糖混剂涂膜处理效果较好。单一壳聚糖涂膜处理组7 d后，花青素含量均急剧上升，说明高分子量壳聚糖涂膜对葡萄花青素合成的抑制作用有效期为6 d。

图3 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄花青素含量的影响Fig.3 Effects of different chitosan coating treatments on anthocyanin contents in grapes

2.5 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄丙二醛含量的影响

丙二醛是膜脂过氧化终产物，常常作为衡量膜脂过氧化程度和细胞损伤程度的指标[18]。随着葡萄的衰老，其MDA含量逐渐升高。由图4可知，在货架期间，壳聚糖涂膜处理组的葡萄较对照组MDA含量增长缓慢，第9天时，壳聚糖混剂处理组MDA含量最低，极显著低于对照组和单一壳聚糖处理组（P＜0.01）。单一壳聚糖处理组葡萄MDA含量变化在6 d内无显著差异，而第7天后，单一壳聚糖处理组的MDA含量急剧上升，而壳聚糖混剂处理组的MDA含量变化不显著，由上可知，壳聚糖混剂处理能有效抑制葡萄MDA的合成，对延缓MDA含量的降低效果较好。

图4 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of different chitosan coating treatments on MDA contents in grapes

2.6 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄呼吸强度的影响

呼吸强度是衡量葡萄生命活动的重要指标，呼吸强度与果实营养消耗和衰老状况密切相关[19]。由图5可知，货架初期，葡萄的呼吸强度较大，随着货架，所有试验组葡萄均出现呼吸强度下降的情况，但对照组下降幅度较小（下降率为30.3%），而所有壳聚糖处理组下降幅度均较大（下降率为58.3%～84.6%），其中壳聚糖混剂处理组抑制葡萄呼吸强度效果最好，9 d共下降了6.245 mL·g-1·h-1，下降率为84.6%，而对照组下降了2.155 mL·g-1·h-1，下降率为30.3%。壳聚糖涂膜处理组对货架期葡萄呼吸强度的抑制显著高于对照组，壳聚糖混剂处理组与对照组及单一壳聚糖处理组均存在极显著差异（P＜0.01），说明壳聚糖混剂涂膜处理对抑制葡萄呼吸强度的作用较明显。

图5 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄呼吸强度的影响Fig.5 Effects of different chitosan coating treatments on the respiratory intensity of grapes

2.7 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄可滴定酸含量的影响

货架期葡萄果实中可滴定酸含量的变化影响其风味及耐贮性[20]，可滴定酸含量的高低直接反应果蔬的品质和成熟度，因此是果实品质重要评价指标之一[21]，可滴定酸同时也是葡萄果实呼吸作用的基质[22]，能有效抑制有机酸的代谢，对保持葡萄的原有风味有重要作用。由图6可知，葡萄果实中可滴定酸含量随着货架期时间的延长呈下降趋势。贮藏期间，壳聚糖混剂处理组的可滴定酸含量下降了1.30个百分点，相对分子量为500 kDa壳聚糖处理组下降了1.37个百分点，相对分子量为50、150、250 kDa壳聚糖涂膜处理组分别下降了1.72、1.95、1.88个百分点，对照组下降最明显，为2.20个百分点，壳聚糖混剂、相对分子量为500 kDa的壳聚糖处理组中葡萄可滴定酸含量极显著高于对照组（P＜0.01），壳聚糖混剂处理组可滴定酸含量极显著高于相对分子量为500 kDa的壳聚糖处理组（P＜0.01），单一壳聚糖涂膜处理组间差异不显著。这表明壳聚糖涂膜处理对葡萄可滴定酸含量的下降均有一定抑制作用，且壳聚糖混剂涂膜处理对葡萄有机代谢有显著抑制作用。

图6 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄可滴定酸含量的影响Fig.6 Effects of different chitosan coating treatments on titratable acid contents in grapes

2.8 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄VC含量的影响

VC是衡量果实营养水平的重要指标，其不但是葡萄营养成分之一，同时也是葡萄内清除活性氧的一种重要的抗氧化剂，对延缓葡萄衰老有一定的作用，但在货架期，VC极易被氧化而损失[23]。

由图7可知，货架期第9天时，对照组VC含量降低最为显著，下降了10.91 mg/100 g，下降率达到71.9%，而单一壳聚糖处理组及壳聚糖混剂处理组随着货架期时间的延长，VC含量逐步下降，但壳聚糖混剂处理组下降最缓慢，仅下降了6.12 mg/100 g，下降率为38.5%。1～8 d时，壳聚糖混剂处理组与单一壳聚糖处理组差异不显著，与对照组差异显著（P＜0.05），9 d时，壳聚糖混剂处理组与相对分子量为500 kDa的壳聚糖处理组差异不显著，与相对分子量为50、150、250 kDa壳聚糖涂膜处理组差异显著（P＜0.05），相对分子量为50、150、250 kDa壳聚糖处理组与对照组差异不显著，这说明更高分子量壳聚糖对保持葡萄VC含量有更明显的作用。

图7 不同壳聚糖涂膜处理对葡萄VC含量的影响Fig.7 Effects of different chitosan coating treatments on VC contents in grapes

3 讨论与结论

壳聚糖及其衍生物对多种果蔬及肉类均具有一定的保鲜防腐作用，路志芳等[24]研究发现，使用不同浓度的单一壳聚糖溶液处理黄瓜，能够使其在贮藏期间的各项生理生化指标均优于对照组。凡玉杰等[25]发现，以壳聚糖为主要成分的复配型壳聚糖涂膜对冷藏银鲳有较好的保鲜效果。而黄盛东等[26]研究发现，不同分子量的壳聚糖具有不同的保鲜效果。本试验在室温下用不同高分子量壳聚糖及其混剂对葡萄进行涂膜处理，结果显示，不同高分子量的壳聚糖涂膜均可有效维持葡萄货架期品质，但保鲜效果存在差异，这与前人的研究成果类似。

由本试验结果可以推断，不同分子量壳聚糖按一定比例混合后，对葡萄的保鲜效果优于单一分子量壳聚糖。已有研究发现，分子量较高的壳聚糖膜透光性较好，透气性较差[27]，并且由于其持水性差，其成膜性也较差[28]，所以水蒸气透性较好；分子量相对较低的壳聚糖膜透光性较差，透气性较好[27]，由于其持水性较好，成膜性好于高分子量壳聚糖[28]，因此较低分子量壳聚糖的水蒸气透性较差。当不同高分子量壳聚糖按照一定比例混合后，混合成膜弥补了不同分子量壳聚糖单独成膜后的不足。混剂中含有不同分子量的壳聚糖，大小不同的分子通过氢键结构相互交织偶联在一起，使得所形成的膜相比单一分子量壳聚糖涂膜，结构更为致密，涂膜后能够阻止氧气的渗入[29]，提高果实内CO2和O2的比值，能更有效地形成高CO2和低O2的微环境，从而降低果实内营养物质的转化和消耗，减少活性氧的形成，调整果实内活性氧代谢，延缓细胞膜的损伤。内环境的变化，可能使果实与衰老相关的酶活性发生变化，从而减少果实的失重率，抑制其呼吸作用，延缓葡萄内可滴定酸、可溶性固形物和VC含量的减少，控制花青素含量的增加，延缓丙二醛的上升趋势[30]，从而延长葡萄的货架期。

单一分子量壳聚糖保鲜膜在应用中还有一定的缺点：一方面壳聚糖膜的透气性缺乏良好的选择性和可调节性，如对O2和CO2通透性的要求，对于不同品种、不同采收期和不同呼吸强度的果蔬，存在较大差异的，而对气体的选择性和可调性不佳，会导致保鲜效果大相径庭，从而影响其应用的广泛性[31]；一方面是膜的机械强度和韧性不够，一段时间后易出现结晶致使膜出现断裂破碎现象[32]，使果蔬部分表面裸露，果蔬仍然受到外界的影响。而不同分子量壳聚糖混合成膜，弥补了膜透性的部分缺陷。

本试验结果表明，相对分子质量为50、150、250、500 kDa壳聚糖按照等比例混合制成的混剂对葡萄的保鲜效果显著优于单一分子量壳聚糖的保鲜效果。深入研究不同分子量壳聚糖以及多种分子量壳聚糖混合成膜与壳聚糖复合膜内外气体交换量的相关性，分析混合膜对果蔬保鲜相关酶的表达情况，探索新型壳聚糖复合膜的抗菌、气体选择通透性及较高机械强度的复合化合物，将是今后研究的方向。