体外代谢技术在毒品检验中的应用进展*

明珠，陈学国，周艳，杜瑞轩，王丹

（中国刑事警察学院刑事科学技术学院，辽宁 沈阳 110035）

毒品是指鸦片、海洛因、甲基苯丙胺、吗啡、大麻、可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品[1]。与毒品相关的违法犯罪活动严重影响经济与文化发展，给社会治安与人身安全等带来巨大隐患。研究毒品的代谢产物和生物转化过程，可以为法庭科学毒品物证鉴定方法选择提供参考[2]。近年来，不法分子通过对现有毒品分子结构的化学修饰或者全新设计，得到生产工艺简单、结构和药理作用与毒品相似的新精神活性物质，该类物质种类繁多，更新迭代速度快，人们对其在体内的作用模式、代谢和毒性知之甚少[3]。新精神活性物质的滥用，给法庭科学毒品物证鉴定带来了巨大挑战。

药物进入机体后的生物转化过程，不仅与靶蛋白质的作用特性密切相关，还与其在体内的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）、排泄（Excretion）和毒性作用（Toxicity）特性（简称ADMET）密切相关[4]。近年来，ADMET 特性的评价和筛选已经成为新型药物研制、药理学和毒理学研究等的关键环节[5]。肝脏作为药物主要代谢器官，是药物生物转化的主要场所，也是富含参与药物代谢细胞色素P450的氧化酶系统，大多数药物的Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在该氧化酶系统的参与下发生的，因此ADMET 中的代谢研究以肝脏为基础[6]。与药物代谢过程相似，毒品被滥用被吸收后，主要在肝脏中代谢，因此，毒品代谢主要以肝脏为研究对象[7]。

毒品具有一定的特殊性，其体内代谢研究的开展受诸多客观不利因素影响。体外代谢技术的发展与应用，为毒品代谢研究提供了新思路[8]。近年来，体外代谢技术已经在毒品代谢物鉴定、生物转化规律研究等方面得到了广泛应用[9]。

1 体外代谢技术概述

1.1 原理与优点

体外代谢技术是指通过体外模型模拟药物在生物体内的代谢过程，鉴定药物代谢物，研究药物在生物体内的代谢规律和生物转化途径，进而阐明药物作用机理的技术[10]。

与体内代谢相比，体外代谢研究有诸多优点：①体外代谢研究可以排除体内诸多的干扰因素，直接观察到代谢酶对底物的选择性代谢，为体内代谢研究提供重要的线索和依据；②体外代谢的代谢物含量大、代谢体系干净，能够解决一些药物在体内代谢转化率低且缺乏灵敏检测手段的问题；③体外代谢研究具有快速、简便等特点，适合大量化合物的药动学筛选；④体外代谢不需要消耗大量的样品和实验动物，研究成本相对较低[11]。

1.2 分类与特点

肝脏是药物在生物体内代谢的主要器官，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，与肝脏相关的体外代谢研究方法主要有肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝匀浆体外温孵法、肝脏离体灌流法、肝组织切片法和基因重组P450酶系等[12]。

1.2.1 肝微粒体体外温孵法

肝微粒体体外温孵法是利用差速离心技术从肝脏中提取肝微粒体，并加入还原型辅酶Ⅱ（NADPH）再生系统，在体外模拟生理环境及温度下进行代谢反应。该方法具有制备技术简单、代谢过程迅速、结果重现性好等特点。另外，在实验过程中，利用该方法可以大量收集代谢样品，以供代谢物结构鉴定使用。因此，该方法被广泛应用在药物体外代谢研究中[13]。

1.2.2 肝细胞体外温孵法

肝细胞体外温孵法是在制备的肝细胞中加入氧化还原型辅酶，模拟生理环境条件下进行的代谢反应。反应中，可以灵活监测肝细胞活性、代谢物及原型药物浓度。该方法高度接近体内生理状态，能较好地保留肝细胞完整形态，维持肝细胞体外活性，是最接近体内肝脏代谢的药物代谢研究体系[14]。

1.2.3 肝匀浆体外温孵法

肝匀浆体外温孵法是直接采用肝脏匀浆，加入药物后，再加入氧化还原型辅酶进行孵育，考察药物代谢的方法。与其他体外代谢方法相比，具有操作简单、实验周期短、成本低等特点[15]。

1.2.4 肝脏离体灌流法

肝脏离体灌流法是在麻醉状态下通过外科手术使肝脏形成体外循环，动态研究药物代谢的方法。该方法能在一段时间内保持离体肝脏生理活性，并在排除整体影响的条件下，具有器官水平优势，兼备体外和整体动物实验的优点，在药理学、毒理学等研究领域得到了广泛应用[16]。

1.2.5 肝组织切片法

肝组织切片法是使用切片机精确切取肝组织用于药物代谢研究的方法。该方法不仅保留了肝脏药酶及各种细胞器的活性，而且也保留了细胞与细胞之间的联系，因此能更准确地反映药物在体内生理条件下的代谢[17]。

1.2.6 基因重组P450 酶系

基因重组P450酶系是利用基因工程及细胞工程，将调控P450酶系表达的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，经细胞培养后表达出高水平的P450酶系，经纯化后可获得纯度高的单一P450同工酶[18]。该方法已经在药物体外代谢途径、代谢产物生成及体外清除率等研究中得到应用。

1.2.7 方法评价

肝脏体外代谢研究方法中，应用最广泛的是肝微粒体体外温孵法。该方法制备技术简单、代谢过程快、结果重现性好、易于大批量操作，并且便于收集代谢样品，缺点是可能与体内代谢的结果出现偏差，需要体内代谢的结果加以佐证。肝细胞体外温孵法最接近人体肝脏代谢的药物体系，能够保持肝细胞的体外活性，高度接近体内生理状态，但肝细胞制备技术复杂，在体外活性维持时间短，不利于储存。肝匀浆体外温孵法的操作步骤最为简单，实验时间短，但肝匀浆中所含的酶种类多，容易对后续的代谢物检测产生干扰，肝匀浆在体外环境下也容易失活，在一定程度上限制了其应用。这些研究方法中，肝脏离体灌流法具有器官水平的优势，能够动态研究药物在肝脏的代谢规律且排除整体影响，但对于设备和操作技术要求高。肝组织切片法能够保留所有的肝脏药酶和细胞器活性，是非常有效的体外代谢研究体系，但受限于肝切片机的性能与价格。基因重组P450酶系，主要应用于研究特异型酶对药物的诱导作用，以确定单个酶的结构和功能，并且不会受到其他酶的干扰，有利于筛选出对药物代谢过程贡献大的酶，但也同样具有成本高、实验条件与体内环境差别大等缺点。

随着科学技术的快速发展，体外代谢体系也在不断完善与健全，已经在药物代谢途径、药物作用机理、代谢产物鉴定等研究中发挥了重要作用。不同的代谢体系各有优缺点，可以根据不同的研究目标，选择合适的体外代谢模型。

2 体外代谢技术在法庭科学毒品物证鉴定中的应用

2.1 鸦片类毒品

鸦片类毒品是一类天然或合成的主要作用于阿片受体的中枢神经抑制剂，包括阿片生物碱及其衍生物。该类毒品是滥用最广泛、依赖性最强、社会危害最大的一类毒品。体外代谢技术在鸦片类毒品分析中的应用主要是研究代谢模式、确定代谢物结构。Wallgren J 等[19]采用肝细胞体外温孵法研究了芬太尼和五种芬太尼类似物乙酰芬太尼、丙烯腈芬太尼、环丙基芬太尼、异丁酰芬太尼、4F-异丁酰芬太尼的代谢，并用液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析代谢物，实验结果表明六种芬太尼类物质的代谢模式相似，主要是羟基化代谢产物，通过与已知尿液样本的对比，确定了六种芬太尼类物质20 种代谢产物的结构，该研究为尿液中芬太尼类物质的检测提供了参考。Winborn J 等[20]结合液相色谱-四极杆飞行时间质谱法，运用基因重组P450酶系研究了二氢脱氧吗啡的生物转化途径，实验发现rCYP2B6、rCYP2C8、rCYP2C9、rCYP2C18、rCYP2C19、rCYP2D6 和rCYP3A4 是参与诱导二氢脱氧吗啡代谢的主要P450亚型酶，并鉴定出其包括去甲吗啡、去吗啡-N-氧化物、去甲羟基吗啡和5 种羟基化代谢物在内的8 种Ⅰ相代谢物。基因重组P450酶系研究毒品的体外代谢，不仅能够确定诱导毒品代谢的P450酶亚型，而且能够得到更加清晰的代谢途径。

2.2 合成大麻素类毒品

合成大麻素类毒品是全球滥用最为严重的新精神活性物质，可同时作用于中枢神经的大麻受体CB1和CB2，产生比传统毒品大麻更强的药理和生理作用。合成大麻素类毒品种类繁多，伪装性强，进入体内后代谢迅速，几乎不以原型的形式排出，这导致对于尿液样本中该类毒品的司法鉴定十分困难。对这类毒品，应用肝微粒体温孵法能够简便、快速地得到其代谢产物，通过分析Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢产物可以推测其代谢途径，确定其生物标志物。黑海等[21]采用肝微粒体体外温孵法研究了合成大麻素N-(1-氨甲酰基-2-苯基乙基)-1-(5-氟戊基)吲唑-3-甲酰胺(PX-2) 的代谢过程，并利用液相色谱-四极杆质谱技术对代谢物进行分析，结果表明PX-2 在肝微粒体模拟的人体代谢过程中，产生了18 种Ⅰ相代谢物和3 种葡萄糖醛化的Ⅱ相代谢物，Ⅰ相代谢主要途径有酰胺水解、氟代戊烷基侧链氧化脱氟、苄基羟基化和吲唑环羟基化等。另外，通过体外代谢实验，推荐了PX-2 的代谢标志物，为公安禁毒工作中PX-2 的检验提供了科学依据。Erol Ozturk Y 等[22]研究了合成大麻素MDMB-4en-PINACA 的体外代谢，采用混合的人肝微粒体孵育后，采用液相色谱-高分辨质谱法对其代谢物进行分析，并与22 份真实尿液样本进行比较，结果发现MDMB-4en-PINACA 在人肝微粒体孵育后共检测到14 种代谢物，并确定了3 种特征代谢产物及生物转化规律。Andersson M 等[23]采用人肝细胞体外温孵法和肝微粒体体外温孵法研究了合成大麻素AMB 和5F-AMB 的代谢过程，并用高分辨质谱仪对其代谢产物进行分析，研究表明AMB 在人肝细胞孵育和肝微粒体温孵后共检测到19 种代谢产物，5F-AMB 检测到17种代谢产物，AMB 和5F-AMB 的主要代谢途径是酯水解、氧化和葡萄糖醛酸化。该研究为鉴定这两种新精神活性物质提供了有价值的数据。

2.3 苯丙胺类毒品

苯丙胺类毒品属于中枢神经兴奋剂，主要包括苯丙胺、甲基苯丙胺、亚甲二氧基苯丙胺和亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）等。目前，体外代谢技术在该类毒品分析中的应用主要采用不同体外代谢模型联用研究特定的苯丙胺类毒品，通过交叉验证不同代谢结果，优化体外代谢模型，准确描述该类毒品的代谢途径，确定标志性代谢物。Richter LH 等[24]研究了MDMA 等8种苯丙胺类毒品在不同体外代谢模型中的代谢过程，分别采用HepaRG 细胞系、HepG2 细胞系和人肝微粒体体外温孵法进行研究，将不同的体外代谢模型进行比较，研究发现HepaRG 细胞系孵育的代谢物在数量和信号丰度上优于HepG2 细胞系和人肝微粒体温孵法。Grafinger KE 等[25]将微生物代谢模型与体外代谢模型联用，采用人肝微粒体模型和秀丽隐杆线虫微生物模型研究了25D-NBOMe、25E-NBOMe 和25N-NBOMe 3 种苯丙胺类毒品的体外代谢，另采用液相色谱-高分辨质谱仪在人肝微粒体中检测到36 种25D-NBOMe 的Ⅰ相代谢物，26 种25E-NBOMe的Ⅰ相代谢物和24 种25N-NBOMe 的Ⅰ相代谢物，在线虫模型中检测到14 种25D-NBOMe 的代谢物，11 种25E-NBOMe 的代谢物和9 种25N-NBOMe的代谢物。该研究发现，3 种目标物的主要代谢过程是氧化脱氨、氧化N-脱烷基化、去甲基化、二醇氧化、单羟基化和二羟基化、伯醇氧化和伯醇羧基化等。

另外，借助毒品滥用者生物样本检测结果，将体外代谢结果与之对比，能够验证体外代谢研究结果的准确性和可信度。Krotulski AJ 等[26]采用人肝微粒体体外温孵法研究了bk-DMBDB 的代谢过程，对其代谢产物进行了表征，并与活体和死亡个体的真实人类样本（血液、尿液、口腔液、肝脏等）进行对比，结果发现检测出的5 种bk-DMBDB 代谢物都在人类样本中得到确认。

2.4 卡西酮类毒品

卡西酮类毒品是近几年来滥用较多的一类兴奋剂，主要包括卡西酮、甲卡西酮等。借助体外代谢技术，结合现代分析方法，将结构相似的卡西酮类毒品进行比较研究，有利于探究该类毒品的代谢规律，为其毒理学研究和司法鉴定提供 参 考。Roque Bravo R 等[27]选 取buphedrone、butylone 和3,4-DMMC 等3 种卡西酮类毒品为研究对象并进行了毒理学研究，采用大鼠肝细胞孵育以及HepaRG 和HepG2 细胞系进行体外代谢，研究了其细胞毒性，结果表明大鼠肝细胞是最敏感的模型，3 种毒品的EC50值最低；肝脏代谢降低了buphedrone 的毒性，但是增加了butylone 和3, 4-DMMC 的毒性；3 种毒品都能增加氧化应激、破坏线粒体稳态、诱导细胞凋亡和坏死。Gavrilović I 等[28]采用人肝微粒体体外温孵法研究了4-MPD、2-NMC、4F-PHP 和bk-EPDP 4 种合成卡西酮类毒品的体外代谢，采用液相色谱-高分辨率质谱法进行代谢产物鉴定，结果表明4 种毒品在体外温孵后得到24 种Ⅰ和Ⅱ相代谢物，主要的代谢途径为去甲基化、O-甲基化、羟基化和葡萄糖醛酸化等，这为法医毒理学分析提供了依据。Camuto C 等[29]采用人肝微粒体体外温孵和基因重组P450酶系的代谢模型，研究了合成卡西酮类毒品Mexedrone的体外代谢过程，结果表明Mexedrone 的主要生物代谢过程是脱烷基化和羟基化。另有研究以甲卡西酮和3,4-亚甲二氧基甲卡西酮为研究对象，基于大鼠肝微粒体S9组分的体外代谢孵育体系，借助液相色谱-质谱联用技术，鉴定得到目标物的主要代谢产物分别为卡西酮和3-羟基-4-甲氧基-甲卡西酮[30]。

2.5 安眠镇静类毒品

苯二氮䓬类安眠镇静类药物自20 世纪60 年代出现以来，品种越来越多，不仅具有镇静催眠、镇定抗焦虑等作用，也具有一定的成瘾性和滥用性，是国家严格管控的二类精神处方药。近年来，国内外市场上出现的新型苯二氮䓬类毒品主要有氟阿普唑仑、二氯西泮和依替唑仑等。体外代谢技术在该类毒品中的应用主要包括模拟体内代谢过程、推测代谢途径、确定标志性代谢物等方面。李乐等[31]通过体外温孵体系肝微粒体代谢模型对4′-氯地西泮和二氯西泮进行代谢产物鉴定研究，结果表明4′-氯地西泮经过代谢共产生5种Ⅰ相代谢产物和2 种葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代谢产物，二氯西泮经过代谢共产生6 种Ⅰ相代谢产物和1 种葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代谢产物，其主要代谢途径为脱烷基化、羟基化以及与葡萄糖醛酸结合。Wagmann L 等[32]对氟普唑仑进行了体外代谢研究，分别采用人的肝脏S9和HepaRG 细胞系进行体外孵育后，使用液相色谱-质谱联用仪进行分析，初步确定了氟普唑仑的代谢产物，并在体外条件下分别确定了参与Ⅰ相和Ⅱ相代谢的酶，进一步将研究结果与真实人体生物样本对比，确定了氟普唑仑的7 种代谢产物，并找到了代谢标志物。该实验还发现，氟普唑仑主要代谢途径为羟基化和葡萄糖醛酸化，其代谢模式与其他的苯二氮䓬类药物相似。Johnson E 等[33]研究了依替唑仑的代谢特征，以0.1 mg/kg 体重的剂量对马进行静脉注射和口服依替唑仑，采集给药前后的血清和尿液样本以确定潜在的代谢物，并利用马肝S9进行体外代谢分析，结果表明依替唑仑在马体内的代谢物有23 种，其中α-羟基化的依替唑仑代谢物含量最高，可作为代谢标记物用于反兴奋剂检测分析。

2.6 致幻剂类毒品

色胺类新精神活性物质是具有致幻作用的一类含有色胺结构框架的化合物，在很多国家被广泛滥用，其通过提高脑内5-羟色胺的水平或抑制5-羟色胺的释放而引起致幻作用[34]。色胺类新精神活性物质种类更新快，数量不断增加，给检验鉴定带来很大难度。对于新出现的色胺类毒品，可以采用肝微粒体体外温孵法进行体外代谢分析，分析其代谢途径与生物转化规律，为色胺类毒品滥用的司法鉴定提供科学依据。Grafinger KE 等[35]对5-MeO-MiPT 进行了体外代谢分析，采用人肝微粒体对其进行体外温孵，在体外代谢模型中检测到7 种Ⅰ相代谢物，其中5-MeO-NiPT、5-OHMiPT、5-MeO-MiPT-N-oxide 和OH-5-MeO-MiPT 4 种代谢物可以在人体生物样本中检测到，由此确定其主要代谢过程为N-去甲基化、O-去甲基化、去甲基化、羟基化、母体化合物的N-氧化物形成和羟基化。Bruni PS 等[36]研究了4-HO-MET 的体外代谢，采用肝微粒体体外温孵法鉴定其代谢产物，实验结果表明体外代谢模型中共检测到12 种4-HO-MET 的Ⅰ相代谢产物，主要的代谢途径为单羟基化、双羟基化、去甲基化、去甲基化与单羟基化结合、形成羧酸、去乙基化和氧化脱氨。

3 体外代谢技术在法庭科学领域的趋势与展望

3.1 不同代谢模型的联用

法庭科学领域体外代谢的研究，主要是为了模拟体内代谢过程，确定代谢物的结构和推测代谢途径，通过将某类毒品的体外代谢产物与该类毒品吸食者的人体尿液样本中的代谢产物进行对比，筛选出标志代谢物，从而为该类毒品吸食者的认定提供依据。但不同的体外代谢模型具有各自的优点和局限性，针对某一种新型毒品的体外代谢研究，采用单一的体外代谢模型往往不能得到全部的代谢产物，导致得出的结论具有较大的局限性。因此，可以考虑将不同代谢模型联用的方法，采用不同的体外代谢模型进行代谢实验，多种体外代谢模型所产生的代谢物之间可以相互补充、交叉验证，然后将得到的代谢结果进行对比筛选，在吸毒者的尿液样本中得到验证，从而为法庭科学中相关案件的侦破提供参考。同时，通过不同体外代谢模型的对比研究，可以挑选出对针对于特定类型毒品最适宜的体外模型，为同类毒品的体外代谢研究提供参考。

3.2 代谢物数据库的建立

随着国际毒品形势的发展变化，具有更高精神活性和成瘾性的新精神活性物质悄然兴起。新精神活性物质种类繁多、更迭速度快，因而对新精神活性物质的研究与监管总是滞后于其出现。目前，我国已列管170 余种新精神活性物质，随着时间的推移，被列管物质还会不断增加，由于缺少对最新滥用新精神活性物质代谢产物的相关研究，导致难以对此类毒品的吸食者进行认定，给司法鉴定和法律监管工作带来了诸多困难。今后可以通过体外代谢技术在毒品检验中的应用，建立毒品及其代谢物的数据库，不断扩充并完善毒品及其代谢物的特征数据库，更好地为涉毒案件物证鉴定提供技术支持，有力打击毒品犯罪。另外，借助现代分析技术手段对体外代谢过程得到的代谢物进行鉴定、分离与提纯，制备出代谢物的标准对照品，必将为毒品研究提供便利，为未来的法庭科学鉴定技术领域提供强有力的技术支撑。

3.3 体外代谢新模型的发展

体外代谢技术发展至今，显示出操作简单、重复性好、能够排除体内因素干扰等特点，并在药物代谢、毒理血和药理学等研究中发挥了巨大作用。借助体外代谢方法，鉴定毒品代谢物、确定生物转化规律，有助于了解毒品在生物体内的代谢途径和代谢特点，能够为涉毒案件的毒品物证鉴定提供科学依据。目前，研究人员在现有的体外代谢的模型上不断创新，建立了新的体外代谢模型，如基于肝细胞代谢发展出的转基因细胞系代谢模型、培养肝细胞模型、永生化肝细胞模型，基于肝细胞亚组分发展出的肝胞质溶胶模型等，这些新的体外代谢模型在将来的毒品分析中都具有较大的研究空间。相信在将来，随着科学技术的不断进步，更加精准、高效的体外代谢新模型将不断被开发出来，体外代谢模型也会越来越接近人体内的真实代谢状态，能够更好地模拟体内代谢过程，提高毒品分析的效率和准确性。