副溶血性弧菌致病性和检测方法研究进展

陈媛媛 王亚男 刘士朋

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus)是一种常见的病原菌，主要栖息在海水中，存在于近海海水、海产品及盐渍食品中。如果食用了副溶血性弧菌大量污染的食品，会引发食物中毒。世界第1例有记录的副溶血性弧菌食物中毒发生在日本，1950年日本大阪发生一起食用青鱼干引起的爆发性食物中毒事件，造成272人发病、20人死亡，日本人藤野从青鱼干中最早分离得到副溶血性弧菌，这是副溶血性弧菌的首次报道[1]。1963年由日本人Sakazaki等正式命名。研究发现，食用被副溶血性弧菌污染的海产品可能会引起急性肠胃炎，一般情况下健康人群感染副溶血性弧菌后症状较轻，重症患者可能会因脱水造成休克，少数患者可出现意识不清、痉挛、面色苍白或发绀等现象，若治疗不及时，甚至可导致死亡[2]。据我国食源性疾病监测网资料统计，副溶血性弧菌已成为我国食物中毒首位病原菌[3]，在沿海地区副溶血性弧菌引起的食物中毒占比高达50%～70%[4-7]。2016年国家食品安全风险评估中心发布《不可忽视的食源性致病菌——副溶血性弧菌》，指出近年来副溶血性弧菌已经跃居我国食源性疾病微生物致病因子榜首。因此，充分了解副溶血性弧菌生物学特性、致病性、污染规律，对预防副溶血性弧菌感染具有重要意义。

1 副溶血性弧菌的生物学性状

1.1 形态与培养特性 副溶血性弧菌属于细菌界、变形菌门、γ-变形菌纲、弧菌目、弧菌科、弧菌属，为革兰氏阴性无芽孢杆菌，大小一般为(0.5～0.8)μm×(1.4～2.6)μm，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等；单端一根鞭毛，运动活泼，两端浓染；排列不规则，多数散在，偶有成对排列。副溶血性弧菌属于嗜盐菌，在无盐的情况下不生长，在含有2%～3% NaCl的培养基内生长最为旺盛，在6% NaCl和8% NaCl的胰胨水中生长旺盛，在10% NaCl的胰胨水中不生长或微弱生长，盐浓度达到>11%时停止生长。适宜生长的pH值为5.3～10，最适pH值为7.4～8.2，最适生长温度为30～37℃。在固体培养基上菌落通常隆起，呈圆形，表面光滑，湿润，一般不会产生色素，但能生长周鞭毛。在肉汤和胨水等液体培养基中菌体生长单鞭毛，运动活泼，浑浊生长，并会在表面形成菌膜。

1.2 生化特性 副溶血性弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂上，能使底层变黄不变黑，斜面颜色不变或红色加深，不产气泡。副溶血性弧菌氧化酶阳性，有动力，分解葡萄糖、甘露醇，分解葡萄糖不产气，不分解蔗糖、乳糖，硫化氢试验阴性，Voges-Proskauer(V-P)试验阴性，β-半乳糖苷酶(ONPG)试验阴性[8]。

1.3 血清学性状 副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原(菌体抗原)，K抗原(荚膜抗原)及H抗原(鞭毛抗原)。其中O抗原为耐热性抗原，经100℃加热后仍保留抗原性。目前已记载12种O抗原和超过70种K抗原[9]。有5种K抗原被发现与两个O群抗原的产生有关，因此，公认有76种血清型。血清学检测还未用于鉴定副溶血性弧菌，因为它们会与许多其他海洋生物发生交叉反应。H抗原为所有菌株共有，无分型意义。

2 副溶血性弧菌的致病性

2.1 流行病学特征 副溶血性弧菌引起中毒的食品主要为海产品(鱼、虾、蟹、贝类等及其制品)，在淡水产品中也可被大量检出[10]。副溶血性弧菌食物中毒多发生在夏、秋季节，发病急，潜伏期短，症状主要为腹痛、腹泻，恶心、呕吐、发热，其次伴有头痛、发汗、口渴等症状。副溶血性弧菌食物中毒常呈集体发生的特点，短时间内骤然发生，病程较短，一般2～3 d即可痊愈，预后良好。目前我国依据WS/T 81-1996《副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则》对副溶血性弧菌食物中毒进行诊断和处理。

2.2 致病毒力因子 副溶血性弧菌的溶血毒素有3种，分别是不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin， TLH)、耐热性溶血毒素 (thermostable direct hemolysin， TDH)和耐热相关溶血素(thermostable related hemolysin， TRH)[11]。

TLH由tlh基因编码，tlh基因对副溶血性弧菌的鉴定具有重要意义，tlh是副溶血性弧菌的种特异性基因，环境分离株和患者分离株都携带该基因[12]。有tlh编码的TLH在我妻氏琼脂上不出现溶血，其功能和致病性尚不完全清楚[13]。

TDH和TRH分别由tdh、trh 基因编码，被认为是副溶血性弧菌最重要的毒力因子。TDH是导致神奈川现象(Kanagawa phenomenon，KP)的溶血素，能耐受100℃ 10 min仍不失活，因此得名耐热性溶血毒素[14]。1984年Kaper等[15]从KP+的副溶血性弧菌中克隆得到编码TDH 的基因，并命名为tdh1，后续研究者发现tdh2、tdh3、tdh4、tdh5基因，与 tdh1 的序列相似性达到 97.20% 、96.75% 、96.70% 和 96.70%， tdh还存在于弧菌属其他菌种。1987年Honda等[16]研究发现一株KP-副溶血性弧菌能产生不耐热的毒素样蛋白，这种毒素蛋白在60℃ 10 min 条件下被灭活，对小鼠具有毒性作用，高剂量可以致死，低剂量致腹泻，该毒素与 TDH 抗原性有交叉，在免疫有相似之处，因此命名为TDH 相关溶血素，即TRH。测序发现 trh与 tdh 基因有70%的序列相似性。

TDH和TRH两种毒素与副溶血性弧菌的致病性密切相关，是判断致病与否的重要标志。调查发现几乎所有临床分离株都产TDH 或 TRH，90% 以上的临床腹泻患者分离株携带 tdh 和trh 基因或者携带其中一种，而环境分离株的携带率不到 6%，这充分说明 TDH 和 TRH 是导致肠胃炎的主要致病因子[16,17]。

3 副溶血性弧菌污染食品情况及流行特点

全世界温带地区的沿海水域和海产品中经常分离到副溶血性弧菌。在日本，因为居民常食用生鱼，副溶血性弧菌是日本食源性疾病的主要致病菌。在美国，食用牡蛎而引发的肠胃炎与副溶血性弧菌有关[18,19]，一些食品如螃蟹、虾和龙虾在食用前已煮过，但一些处理不当的做法，如冷冻不适当、加热不充分、交叉污染或者二次污染都可能是疾病爆发的原因。1997年的西海岸[20]、1998年的纽约和德克萨斯州[21]的副溶血性弧菌爆发就可能与生吃牡蛎有关。在西海岸分离到的临床菌株是尿素酶阳性，同时含有tdh和trh基因，德克萨斯州和纽约分离到的菌株是尿素酶阴性，O3：K6血清型，仅含tdh基因[20,21]。O3：K6血清型菌株已成为流行菌株，也是亚洲最常见的菌株[22,23]。

我国不同地区有副溶血性弧菌监测事件的相关报道。北京市海淀区2010至2019年共发生143起食源性疾病暴发，有66起检出致病菌46.2%，共检出272株致病菌，其中副溶血性弧菌占30.1%(82株)，占比最高，其次为变形杆菌占25.7%(70株)、金黄色葡萄球菌占19.9%(54株)[24]。江苏省2010至2018 年在13个市不同场所采集8类淡水产品1 170份中，副溶血性弧菌检出率 28.0%，污染水平为- (1.01±1.58) lg MPN/g，毒力基因携带率3.7%，淡水虾类污染水平最高为-(0.44±1.68)lg MPN/g[25]。辽宁省2021年在420份市售水产品中，副溶血性弧菌检出率为 29.29%(123/420)，海水产品检出率为33.44%，海水贝类检出率最高为49.51%， 其中淡水产品中河蟹检出率较高为61.29%，123 株菌 tlh 基因均阳性， tdh 和 trh 基因均阴性[26]。副溶血性弧菌主要污染生食产品和鲜活产品， 检出率分别为 8.9% (16/180)和 6.0% (18/299)[27]。广州市2018年对水产品致病菌监测中发现副溶血性弧菌检出率最高，为47.22%(102/216)，102株副溶血性弧菌均表达 tlh 基因，均不表达 trh 基因，有2 株菌株表达 tdh 基因[28]。厦门市 2012至2016 年在408份海产品监测中检出副溶血性弧菌165 份，检出率40.44%，其中，贝类的检出率最高，为66.06%，9月和10 月检出率最高，为61.43%，农贸市场的检出率最高，为 66.67%[29]。

4 副溶血性弧菌食物中毒事件

吴国杰等[30]对江门市一起导致47人病例的食物中毒事件进行调查，通过细菌分离培养、检验和脉冲场凝胶电泳分子分型技术对采集病例肛拭子和剩余食品等进行检测，罹患率42.7%，回顾性队列研究发现危险食物是烧鸭，从剩余食品和病例的肛拭子中检出副溶血性弧菌，血清型为O3∶K6，PFGE分子分型显示高度同源，综合判定O3:K6血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒，可能是副溶血性弧菌污染了烧鸭，食用前未彻底加热。

2021年敖华英等[31]报道，阳江市G医院和B医院同一天分别收治6名和12名出现腹泻、伴腹痛、呕吐症状的旅行团人员，对可疑餐次及可疑食物进行病例对照研究,对病例样本及食品、环境进行常见食物中毒致病菌的实验室检测，结果共发现24名病例,主要临床症状为腹泻(100.00%)、伴腹痛(91.67%)、呕吐(33.33%)。病例对照研究发现凉拌海蜇是可疑食品。检出副溶血性弧菌,血清型为O10∶K4，综合判定凉拌海蜇可能受到副溶血性弧菌的污染,是导致食物中毒的原因。

曾凡夫等[32]报道一起导致90人中毒的建筑工地食物中毒事件,罹患率17.7%(90/509),临床表现以腹泻(95.4%)、腹痛(77.8%)和呕吐(53.3%)为主,对病例样本进行检测，副溶血性弧菌阳性率70.7%(65/92),血清型为O3∶K6,经PFGE分析,9份病例肛拭子样品为100.0%同源。

孙健等[33]报道调查S公司14名疑似食物中毒患者食物中毒事件的致病因子和原因, 结果显示,流行病学曲线推断此次事件中毒餐次是7月22日晚餐,回顾性队列研究提示,烧鸭与患者发病有关(RR=5.06,95%CI∶1.33～19.26),在14名患者肛拭子、剩余食品烧鸭、腌制秋刀鱼中均检出同源性副溶血性弧菌(O3∶K6血清型)。综合判定此次食物中毒致病因子是副溶血性弧菌,食堂从业人员违反食品安全操作规范,造成生熟食物交叉污染是此次食物中毒的主要原因。

孙晓岩等[34]报道101份医院送检的患者腹泻便样中，检出副溶血性弧菌阳性28份，属于含副溶血性弧菌特异基因的O1∶K56血清型，tdh显示阳性，但trh呈阴性，显示这些菌群可能表达耐热直接溶血素，但不表达直接耐热相关溶血素。

张晶等[35]报道2017年广州市一起副溶血性弧菌食物中毒特征，采用血清型鉴定,药敏实验,毒力基因(tdh、trh、tlh)、toxRS/new基因、orf8基因的PCR检测, PFG)和MLS)进行分析。14株副溶血性弧菌血清型鉴定为O8∶K21,药敏试验显示14株菌对氨苄西林、甲氧苄氨嘧啶耐药,对头孢曲松、环丙沙星、氯霉素、磺胺甲口恶唑/甲氧苄啶、磺胺复合物、阿米卡星、萘啶酸、链霉素、四环素、庆大霉素敏感。毒力基因全部为tdh+ tlh+ trh-,均携带toxRS/new和orf8基因。经PFGE聚类分析,14株判断为高度相关株。经MLST分析,结果全部为ST479型。结论引起此次食物中毒的病原菌是副溶血性弧菌O8∶K21型,彼此具有共同的遗传特征,携带大流行克隆株的标志性基因,应进一步加强对此类菌株的监测和控制。

2020年钟延旭等[36]报道，2019年广西W市W酒店发生一起聚集性食物中毒，累计报道食物中毒病例140例，中毒罹患率12.5%(140/1 116)，平均潜伏期12 h，主要症状为腹泻100%(140/140)、腹痛94.3%(132/140)、呕吐58.6%(82/140)、恶心55.7%(78/140)，从11名患者、6名从业人员(发病2名、为健康带菌者4名)、1份剩余食物、2份废弃原材料(扇贝壳和生蚝壳)中检出副溶血性弧菌，综合分析确定该事件为一起副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，致病原因为生熟交叉污染。

郭凯纯等[37]报道2018年10月广州市一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件，血清型均为O8：K21,药敏分析对14种抗生素反应大致相同，其中对氨苄西林100%耐药。副溶血性弧菌有75种血清型与人类腹泻有关，广州地区腹泻患者临床分离株种，血清型O3:K6和O4：K8为优势性别，二者所占比超过所有血清型的九成，O8：K21鲜少出现在副溶血性弧菌引起的食物中毒相关论文中，研究表明独立基因可通过水平转移方式从不同属的致病性弧菌转移到无毒的副溶血性弧菌中。

王尔群等[38]报道采用GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》、WS 271—2007《感染性腹泻诊断标准》方法,对食物中毒的样本(患者大便/肛拭29份,厨师肛拭5份,食品及环境样本23份)进行病原菌分离,对分离的病原菌进行血清学分型鉴定,运用荧光定量PCR进行tdh、trh毒力基因检测,脉冲场凝胶电泳技术进行同源性分析。结果从57份标本中分离到29株副溶血性弧菌,27株血清型为O4:KUT型,2株副溶血性弧菌的血清型为O1:KUT。PFGE聚类分析显示,指纹图谱按100%相似度,可分为3种PFGE带型(P1、P2、P3),P1和P2带型之间相似性较强,为94%～96%,P3与P1和P2带型之间的相似性都较差,为<70%。毒力基因检测结果为,P1和P2型(27株)tdh+/trh-,P3型tdh-/trh-,tdh携带率为93.10%。综合判定此起食物中毒主要为O4群携带有tdh毒力基因的多种不同型别副溶血性弧菌引起,污染源主要来自鱼。

覃芳葵等[39]报道简阳市某酒店发生一起食物中毒事件，搜索到病例74例，临床症状以腹痛、腹泻、恶心、呕吐为主，发病潜伏期最小值7.5 h，最大值25.5 h，中位数14.5 h。3名病例肛拭子、留样食品私房熏鱼和凉拌猪耳朵共5件样品PCR检测到副溶血性弧菌言行，凉拌猪耳朵、荷兰豆拌豆干、口口脆共3件样品细菌培养副溶血性弧菌阳性，调查发现酒店未配备食品加工器具消毒设施、食品盛装容器洗消不规范和热菜间存在盛装容器生熟交叉污染的问题，可能污染途径为生熟交叉污染。

周萌等[40]报道北京海淀区一起副溶血性弧菌食物中毒流行病学调查，共搜索到29例病例，有共同进餐史，临床症状相似，以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热为主，在8份病例肛拭样品、1份呕吐物样品、1份可以食品卤制鸭腿样品中检出副溶血性弧菌。

虽然副溶血性弧菌主要存在于海产品中，但是直接导致副溶血性弧菌食物中毒的食品并非都是海产品，凉拌菜、熟肉制品也曾检出副溶血性弧菌，肉禽食品、蔬菜和熟食制品等由于加工保存不当受到污染后，细菌大量繁殖，食用后皆有可能引起食物中毒事件的发生。

5 副溶血性弧菌检测标准

5.1 限量要求:副溶血性弧菌食物中毒的发生与摄入量有关，试验证明其感染量为105～106CFU[19]。在我国食品安全国家标准体系中，GB 29221-2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》和GB 31607～2021《食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》规定了检验副溶血性弧菌的产品种类、检测方法、限量要求。GB 29221～2021规定了即食生制动物性水产制品和即食水产调味品需检测副溶血性弧菌，检测方法为GB 4 789.7，限量均设定为“n=5，c=1，m=100 MPN/g， M=1 000 MPN/g”(n：同一批次产品应采集的样品件数，c：最大可允许超过m值的样品数，m：微生物指标可接受水平限量值，M微生物指标的最高安全限量值)。GB 31607-2021规定部分或未经热处理的含动物性散装即食水产品需检测副溶血性弧菌，检测方法为GB 4789.7，限量为≤1 000 MPN/g(ml)。在日本，副溶血性弧菌在生食海产品的限量为104CFU/100 g。

5.2 检测标准

5.2.1 食品安全监督抽检标准:在我国食品安全监督抽检中，依据GB 4789.7-2013 《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》对副溶血性弧菌进行检测。GB 4789.7-2013为传统培养法，检测步骤分为：样品制备、增菌、分离、纯培养、初步鉴定、确定鉴定、血清学试验(选做)、神奈川试验(选做)。其中增菌分为定性检测和定量检测两种，定性检测是将样品接种到3%氯化钠碱性蛋白胨水36℃培养8～18 h后，划线TCBS或弧菌显色培养基。定量检测是采用MPN 9管法，将样品接种到3%氯化钠碱性蛋白胨水后，选择3个适宜的连续稀释度分别接种3%氯化钠碱性蛋白胨水3管后，划线TCBS或弧菌显色培养基。两种方法后续通过氧化酶、革兰氏染色、3%氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性等试验进行鉴定。GB 4789.7-2013传统培养法，总检测时间为48～120 h。

5.2.2 进出口食品检测标准:在我国进出口食品检测中，副溶血性弧菌检测依据标准有5个，均是采用不同于GB 4789.7-2013传统培养法的分子生物学检测方法，分别是：SN/T 1869-2007《食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法》、SN/T 2424-2010《进出口食品中副溶血性弧菌快速及鉴定检测方法实时荧光PCR方法》、SN/T 2754.5-2011《出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第5部分：副溶血性弧菌》、SN/T 4603-2016《出口食品及水体中产毒副溶血性弧菌常见致病基因检测方法多重PCR及多重实时荧光PCR法》、SN/T 5364.1-2021《出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法第1部分：副溶血性弧菌》。

其中，SN/T 1869-2007是采用普通PCR技术，通过扩增450 bp的tlh靶基因，快速检测副溶血性弧菌；SN/T 2424-2010是针对gyrase基因设计特异性引物和探针，采用全自动荧光定量PCR仪或普通PCR仪合并微量荧光检测器进行检测；SN/T 2754.5-2011是根据特有靶序列tox S基因设计两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的6个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在toxS基因序列启动互补链合成，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，加入显色剂，通过颜色变化观察判定结果；SN/T 4603-2016则可以判定是否含有副溶血性弧菌及产毒副溶血性弧菌，第一法是通过同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh和trh致病基因，根据扩增条带(gyrase 91 bp；tdh 269 bp；trh 458 bp)的有无判定，第二法是通过同时检测tdh和trh基因，根据荧光通道出现的扩增曲线和相应的Ct值判定；SN/T 5364.1-2021是针对副溶血性弧菌β-内酰胺酶编码基因(blaCARB)保守序列设计引物探针，采用微滴式数字PCR进行检测，规定检测限为～5 CFU/25 g(或～5 CFU/25 ml)，是首个设定检出限的副溶血性弧菌检测标准。

从进出口食品5个检测标准可以看出，对副溶血型弧菌检测方法经历了由普通PCR发展到荧光PCR再到数字PCR，从仅检测副溶血性弧菌到检测致病性的副溶血性弧菌，再到定量检出限的过程，相比较GB 4789.7-2013传统培养检测法，具有快速判定定阴性样品及区分致病性和非致病性菌株的优势。

6 副溶血性弧菌食物中毒预防方法

国家食品安全风险评估中心发布《不可忽视的食源性致病菌——副溶血性弧菌》提到预防食源性疾病，要做到世界卫生组织推荐的食品安全5要点：在日常生活中要做到保持清洁；食物生熟分开切分开储存；食物要烧熟煮透完全煮熟；食物要保存在安全的温度下；确保水和食物原料安全。副溶血性弧菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，预防副溶血性弧菌的关键措施是不生吃海产品，同时防止交叉污染。