基于毛细作用的微藻固定化培养装置设计及培养条件研究

杨婷 黄磊

（1.泉州师范学院交通与航海学院 福建泉州 362000；2.陆军装备部驻南京地区军事代表局驻南京地区第二军事代表室 江苏南京 210003）

随着人们环保意识的不断加强与气候变暖及能源枯竭带来的影响越来越显著，对于可再生能源的研究正在如火如荼地进行着。资料显示，利用微藻作为原料，每公顷的产油量是玉米的348倍，是大豆的68倍[1]。吸附法是利用的是微藻在固体表面由表面静电力与自身分泌的黏性物质（Extracellularpolymericsubstances,EPS）的相互作用所产生的贴壁生长的效果，从而在固体载体表面产生生物膜，但由于这种吸附结构较不稳定，在吸附式的固定化培养过程中藻细胞很容易受到流动的培养液的冲刷而脱落。在微藻的培养过程中使用固定化技术，不仅可以增加微藻生物膜的产量，而且适当改变与优化一些培养条件后，微藻细胞中有高经济价值的代谢产物的产量也会得到提升。

本实验采用固定化培养模式，利用毛细作用的原理进行营养物质的传递。在垂直的空间内构建出培养载体，提供含水量少但较为湿润的固体培养基为微藻细胞提供营养支持。此培养方法可以提高微藻细胞与碳源、光源的接触面积，从而提高微藻的光合作用效率，使其达到快速生长的目的。本实验运用毛细作用原理进行营养传质内在机理的研究，针对固定化培养条件下微藻的生长特性以及空间光稀释原理和太阳光在微藻固定化培养反应器中的运用与实施分析，进行了微藻固定化光学反应器的设计与搭建，并研究了微藻藻株的属性不同，承载体材质表面的粗糙度及材质制作工艺的差异对微藻的生物质产率和固定化率的影响。利用此反应器对微藻藻种以及培养承载体进行筛选，以获得最适合的培养藻种与培养载体。将不同材料的载体（人造棉、帆布、氨纶和纱布）与不同种类的藻株（Chlorella pyrenoidosa、Chlorella sp.、Scenedesmus dimorphus、Haematococcus pluvialis、Chlorella vulgaris）进行交叉培养研究，筛选出最优的培养组合。利用所得组合进行复合载体与单一载体在营养传质效率，微藻生长空间等方面的研究。并且分析培养周期、接种密度等对生物质产量的影响。

一、材料与方法

（一）藻种。本实验选用五种带有明显差异性的藻种作为培养原料，其分别为雨生红球藻（Haematococcus pluvialis FACHB-712）、小球藻（Chlorellasp.FACHB-31）、二型栅藻（Scenedesmus dimorphus FACHB-496）、蛋 白 核 小 球 藻（Chlorellapyrenoidosa FACHB-9）、普通小球藻（Chlorella vulgarisFACHB-1072）。此部分藻种来自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库。用于培育其生长的培养液为Modified Basal培养液，其配方见表1。按配方要求将培养液配置完成后需在高压灭菌仪器中经过121℃高温灭菌15分钟，经灭菌后冷却至室温，利用1M的HCL和NaOH溶液将pH调至7即可。微藻育种培育所使用的容器为150mL锥形瓶，每一育种的锥形瓶内需加入100mL左右的培养液，其后在无菌的环境下加入适量的藻液，放置于水平循环旋转的摇床上，将时速设置为105rpm；利用日光灯为微藻提供生长所需的光源，光照强度为100μmol/m2/s，培养周期中每日光照时间为12h；环境温度为25±2°C。

表1 Modified Basal培养液配方

（二）培养基与固定化载体材料。本实验所选用的培养基与上文育种所使用的培养基一致都为Modified Basal培养液，具体成分见表1。

承载体选用四种多渗透孔隙亲水材料作为备选，具体为氨纶、纱布、帆布以及棉布，实验过程中将其裁剪为10cm×100cm的规格。

骨架材料选取了两种高聚合物材料聚丙烯（Polypropylene）与聚四氟乙烯（PTEF）、一种金属材料不锈钢（Stainlesssteel）以及一种混合物材料玻璃（Glass）作为骨架部分的备选材料，在实验过程中均裁剪为10cm×50cm的规格。

（三）仪器设备、药品与收获方式及测定方法。

1.实验中用到的主要仪器见表2。

表2 主要实验仪器

2.药品来源。实验中用到的主要药品见表3。

表3 主要实验试剂

3.收获方式及测定方法。生物质的收获方式：相较于悬浮培养的方法，固定化微藻生物质培养方式简化了传统采收后离心、过滤等步骤。由于微藻生物质在固定化培养过程中，细胞是在承载体的表面进行生长。在收获时，只需利用收获刀片，按照相同频率与相同力度的经验刮削方法将藻细胞刮入额定300mL的蒸馏水中。

生物质浓度DW测量:将采收后的藻液摇匀，抽取适量（如10mL）藻液进行抽滤。所用的滤纸为预先烘干（95℃，4小时）且参数为直径60mm、孔径0.45μm的玻璃纤维滤纸。并且预先用浓度为0.65M的甲酸铵溶液洗去培养液中析出的结晶盐，将抽滤后的带有微藻生物质膜的滤纸置于95℃的烘箱内干燥4小时。将过滤后的滤纸重量减去过滤前的滤纸重量，其重量之差便是抽滤体积状态下的微藻生物质干重DW。

微藻的生物质产率ABP与吸附率AR根据以下公式计算得出：

其中；DW2为从承载体表面收集的微藻生物质浓度（g/L）；V2为微藻固定化培养收获体积（L）；A为培养单元的占地面积（m2）；DW1为储液槽中悬浮部分的微藻生物质浓度（g/L）；V1为微藻悬浮培养体积（L）；CP为培养时间（day）。

4.提油及产油量测定。油脂提取与含油量计算：在进行提油前，需要对微藻进行破壁处理，利用珠磨破壁机配合0.5 mm玻璃珠破壁3min。加入与破壁藻液等体积的正己烷进行萃取，利用涡流振荡器将两者均匀混合，离心分层（4000 rpm，3 min），此后抽取收集悬浮自上层溶有油脂的正己烷，重复两次。并将抽取收集的溶有油脂的正己烷溶液移至体积为50 mL的圆底烧瓶之中，烧瓶预先经历洗净、95℃干燥1.5小时、置于干燥器冷却、称重的预处理。利用旋转蒸发仪在真空条件下38℃的水温中将正己烷挥发，挥发后的正己烷经冷凝管后回收。经此步骤后，油脂将置于圆底烧瓶底部；将其移入95℃的干燥箱中干燥1.5小时，之后冷却至室温、称重。含油量LC的计算公式如下：

其中：W1为油脂提取前空圆底烧瓶的重量（g）；W2为装有油脂的圆底烧瓶重量（g）；DW为破壁微藻的生物质溶度（L），V为破壁微藻的体积（L）。

（四）实验设计原理及步骤。

1.微藻固定化培养反应器设计。图1所显示的为本实验方法设计的培养装置。该反应器的主要组成部分包括：密闭培养单元、培养载体单元、光源供给系统、CO2发生及供给装置、流量监测系统与通气道。其中培养液的贮藏装置为标准750mL的矩形容器组成。承载体竖直悬挂于矩形容器上方，并底部部分区域（竖直高度3-5cm）浸没于培养液中，主要作为营养传递系统的起始端，利用液体的蒸腾作用作为驱动力，使得培养液在承载体的毛细管间隙中自下而上的运动。实验中所采用的CO2供给系统为化学反应式的发生装置。结合培养区域容积及在培养环境中所需的CO2（5%）组成浓度，计算出所需的小苏打与柠檬酸的具体用量通过化学反应的形式产生，并且利用气体的压力将CO2气体压入培养单元。由于CO2气体较空气有着更大的密度，将进气管道的输出端布置于培养区域的上部。气体发生系统与培养区域组成统一的整体，光源采用双侧光源的设计，每侧光照强度在0-350μmol/m2/s。

图1 固定化培养装置的二维剖面图

图2显示了复合载体培养系统的三维布置形式。该实验装置在上述培养装置的基础上进行改进优化，将提供微藻生长所需空间的承载体贴附于固体骨架材料表面，组合成复合载体，其余部分与图1所示装置一致。

图2 基于毛细作用的微藻固定化复合载体培养系统

2.毛细作用原理。毛细作用的主要驱动能来源于光能[2]，光能作用于承载体表面后，承载体内部的液体吸收光能后产生热量，并在承载体表面产生蒸腾作用，这部分的蒸腾作用将改变毛细作用内部原来保持的力学平衡。如公式4及图3所示，根据能量守恒定律可知，当液体在上升的过程中，其吸收进入培养单元光能Iir的部分能量后将会转变为液体蒸发所需的能量ET。而这部分水量蒸发之后承载体内部液体的压力发生改变，导致储液槽中的液体产生向上的动能，最终将转换为液体上升的重力势能EP。贴附于承载体表面的微藻细胞吸收光能部分能量，将其转换为生物质能EB。并且由于整个过程并不为完全的理想状态，将会产生一部分的能量损失Qex。

图3 毛细作用固定化培养方式原理图

3.固定化藻种筛选实验。利用如图1所示反应器，选取五株差异性明显的藻种，在接种密度为10g/m2，双侧光照，每侧光照条件为300μmol/m2/s（日光灯）；环境温度为26±3℃，通入浓度为5%的CO2混合气体，昼夜周期为12/12的条件下进行为期5天的微藻固定化培养实验。培养初期储液槽中加入500mL的Modifiedbasal培养液，每天为其补充损失的培养液补偿消耗。以此探究不同藻种对本固定化培养方法的适应性，并筛选出最适合固定化培养的藻种用于后续实验，实验分组如表4。

表4 藻种筛选实验安排

4.固定化承载体筛选实验。本实验以微藻在培养周期内的生物质产量及固定化率为评判标准，利用上述实验所得的最适宜固定化培养的微藻作为培养藻种，选取四种多渗透孔隙材料作为培养承载体，实验条件与上述实验条件相同。探究承载体材料的差异性对微藻生长所产生的影响，具体实验分组如表5所示。

表5 承载体筛选实验安排

5.骨架部分对承载体毛细作用的影响实验。选取裁剪尺寸相同（10cm×100cm）的帆布、氨纶、以及纱布作为承载体材料，利用玻璃作为骨架材料进行骨架部分对承载体毛细作用的影响实验。利用红色墨水将培养液体槽中的Modified Basal培养液做标记，以便直观地观察到液体上升的最大高度。各组复合载体试样垂直悬挂于储液槽上方，并保持载体底部与染色培养液接触，接触高度约为3.5±0.1cm。将实验组静置一天，以液体的上升高度作为毛细作用效果的评判标准，具体实验分组如表6：

表6 毛细作用差异实验安排

6.固定化复合载体组合筛选实验。基于前上述实验所得的产量与固定化效率最高的两种承载体材料氨纶（Spandex）与帆布（canvas），将这两种材料分别贴附于玻璃（Glass）、聚丙烯（Polypropylene）、聚四氟乙烯（PTEF）与不锈钢（Stainless steel）组合成复合载体。利用小球藻（Chlorella sp.）作为藻种，进行为期五天的固定化培养，培养条件与上述实验相同，实验安排如表7。

表7 复合载体筛选实验安排

二、结果与分析

（一）藻株属性不同对毛细作用固定化培养的影响。本次实验藻种筛选结果如表8，五种预选藻种均可在承载体为氨纶的表面生长，将固定化产量与悬浮部分产量对比，生物膜的产量都有不同程度的提升（约为6.5至27g/m2/day）。可能的原因是微藻在固定化载体表面生长，相对于悬浮培养其光能的传输与利用率得到了提升，并且增大了微藻与CO2的接触表面，提高了微藻的光合作用。这与Ji等在研究中提出的固定化培养方式中微藻对于光照的利用对于悬浮培养更加恒定与高效，并消除了CO2经培养液溶解转换成HCO-3再转换成CO2分子的步骤，使微藻可直接利用CO2分子提高了微藻的固碳效率的结论相同[3]。由于藻种属性的差异导致其悬浮培养的生长情况也不尽相同，小球藻（Chlorellasp.）与核蛋白小球藻（C.pyrenoidosa）悬浮培养产量相近，但固定化培养差异明显。小球藻（Chlorella sp.）高效的固碳效率在固定化培养中优势明显，经五天的培育生长其单位面积的固定化产量明显要高于其余四种藻株的单位面积固定化产量，达到最大的30.65±1.050g/m2/day，与此同时固定化率也达到了80.972±2.169%。然而固定化率最高的藻种并非小球藻（Chlorellasp.）。雨生红球藻（H.pluvialis）在固定化培养后达到了83.912±3.742%的固定化率。这是由于相较于其他微藻雨生红球藻的体积较大，单独个体所需的能量较体积较小的藻株个体要大，在悬浮培养状态下由于营养传质效率较低生长较为缓慢[4]，在悬浮培养状态下与其他藻株相比较其悬浮生长的产率较低。

表8 五类微藻毛细作用固定化培养生物膜产率及固定效率

（二）培养载体材料的不同对微藻生长的影响。研究表明，微藻可在某些固体表面生长，2010年Johnson and Wen研究发现小球藻（Chlorella sp.）在聚苯乙烯泡沫板的生长状态要好于硬纸板、聚乙烯以及海绵[5]。2014年，Lee等利用污水进行微藻的固定化培养，发现使用尼龙是一种较为经济且效果突出的固定化培养载体[6]。近年，Zhang等利用富集静电力的毛绒布料作为固定化载体也取得了60g/m2/day的生物膜产量[7]。

图4（a）所示数据显示，以帆布、氨纶、纱布和棉布这四种材料作为微藻的承载体，微藻均能在其表面生长。微藻生物质的产量较悬浮培养方法有所提高。通过数据分析发现产量最少的棉布承载体与其他三种材质的承载体还是存在一些差距，可能原因是对比这四种材料，棉布的整体质地较为纤细，在培养的过程中耐受性不强，影响了微藻的贴附以及毛细作用的营养传质，也反映出固定化承载体的材质是微藻积累生物膜的一个重要影响因素。资料表明，材料表面的粗糙度，亲水性及生物毒性等都会对微藻的生长产生影响[8-9]。在四种材料中，帆布的表面粗糙度最大，微藻在其表面遇到的阻力也最大，这便导致了微藻脱落率较低，使其微藻的固定化率达到最大值85.18±3.89%。但也是由于表面粗糙度较大，使微藻的生长扩张阻力较大，该承载体表面的生物膜产量并未达到最大值。相较帆布，氨纶的表面较为光滑，并且材质有弹性。针织结构中的松散间隙也促进了毛细作用的效果。在收获时，由于氨纶表面较为光滑且材质较为轻薄，最终获得了最大的生物膜产量31.0±1.1g/m2/day。

图4 微藻在不同培养承载体上的产率及固定化率

（三）骨架部分对承载体毛细作用的影响。图5显示了帆布，氨纶以及纱布贴附于玻璃骨架后液体上升高度所产生的变化程度。以帆布作为承载体的复合载体，液体所能上升的高度最高，可以达到38.672±0.778cm。而若单纯使用承载体进行毛细作用，所达到的最低高度仅为18.906±0.444cm。将各承载体材料是否加入骨架部分液体上升的高度进行对比，发现帆布在加入骨架部分后液体上升的改变量最大，骨架部分的加入对帆布的影响效果最为明显。可能的原因，帆布较其余两种材料厚度较大，吸水量较多，并且表面凹凸较为明显，与固体骨架玻璃接触后吸力较强，对骨架的正压力较大，提高了液体在复合载体表承托效果。

图5 三种承载体贴附于玻璃骨架后与单一载体时所产生的毛细作用差异

从图5所示，将不同的载体材料贴附于玻璃材质的平板表面（作为骨架）后液体上升高度都有了一定的提升。承载体与骨架的接触面存在较大的缝隙，这样便在接触表面产生二级的毛细管作用。随着液体的高度不断上升，缝隙间的液体使承载体与骨架产生桥接的作用[10]，并且由于此状态下表面张力的方向并不竖直向上，产生面向骨架部分的分力将促使承载体向骨架材料贴附，导致了缝隙液体在上升的过程中所处的毛细孔径不断减小，孔径的液体压力不断上升。研究表明，当液体内部压力处于改变的状态时，会产生沿改变方向的毛细作用力[11]，由此在一定程度上增强了复合载体的毛细作用效果。

（四）复合载体的组合方式对微藻生长所产生的影响。图6中的A与B分别为采用氨纶与帆布贴附于4种固体骨架后的微藻生物膜产量与固定化效率的差异。从A与B中的数据可以看出，在不同的复合载体条件下，微藻生物质的产量呈现在26.6±0.1g/m2/day到49.15±0.75g/m2/day的范围，最大的产量发生在使用帆布作为承载体与聚丙烯作为骨架的复合载体，其经五天培养后达到了245.75g/m2，并且微藻的固定化率也达到了最大值92.50±1.02%。对此微藻进行提油，微藻生物油产率分别为38.56%和18.95 g/m2/day。对比不同承载体材质对微藻生长所产生的差异，微藻在帆布作为承载体的复合载体上的固定化产率要好于使用氨纶作为承载体的复合载体。可能的原因是帆布的厚度与其保水量要好于氨纶，并且与氨纶光滑的表面不同，帆布的表面较为凹凸，贴附于固体骨架后产生的毛细压力较大，两者贴附性较好，为微藻以及培养液的传质提供了较好的支撑作用。

图6 骨架及承载体材料组合筛选

三、结论

基于毛细作用以空间光稀释原理和太阳光能量利用为基础设计并搭建的微藻固定化培养光生物反应器在能源微藻产量的培养方面较传统悬浮培养方式有较大的提高：基于毛细作用的微藻固定化培养方式具有可行性，可以达到营养传质与微藻生长的目的，相较悬浮培养方法，此固定化培养方法提高了土地的利用率增加了微藻单位面积的产量。在以氨纶为载体的微藻固定化生物反应器的藻株筛选实验中，不同藻株的藻种生物膜的产量都有不同程度的提升，小球藻（Chlorellasp.）高效的固碳效率在固定化培养中优势明显，其固定化产量达到30.65±1.050g/m2/day，固定化率也达到了80.972±2.169%。而藻株细胞较大的雨生红球藻（H.pluvialis）在固定化培养后达到了83.912±3.742%的固定化率。表面较为光滑且材质较为轻薄的氨纶，收获中的损失量较少，获得了最大的生物膜产量31.0±1.1g/m2/day。表面粗糙度最大的帆布，其固定化率达到最大值85.18±3.89%。固体骨架有助于提高复合载体毛细作用的效果，适当的承载体与骨架的组合可以增加营养液的传质效率，扩大培养区域的面积，提高微藻的产量。在不同的复合载体条件下，微藻生物质的产量呈现在26.6±0.1g/m2/day到49.15±0.75g/m2/day的范围，最大的产量发生在使用帆布作为承载体与聚丙烯作为骨架的复合载体，其经五天培养后达到了245.75g/m2，并且微藻的固定化率也达到了最大值92.50±1.02%。对此微藻进行提油，微藻生物油产率和产量分别为38.56%和18.95g/m2/day。