太赫兹波对小鼠肺癌细胞影响的研究*

董 琦 杨晶莹 熊子洋 肖移生

江西中医药大学中医学院，江西省南昌市 330004

太赫兹波(Terahertz wave, THz)是20世纪80年代中后期才被正式命名的、频率范围在0.1～10THz、波长范围在0.03～3mm、介于微波与红外光波之间的一种电磁波。THz具有强穿透、低能性特点,对许多介电材料和非极性物质都有良好的穿透性，且其能量在meV数量级、是普通X射线的几百分之一。目前，国际上普遍认为THz是一种有很多独特优点的新辐射源，会给通信、航天、电磁武器、国防、天体研究、无损安检、生命科学、医学等领域带来深远的影响[1]。

已有研究发现，RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空间构象、振动能级和氢键能等都处于THz段，故生物体被THz穿透过程时会产生多种独特的响应[2-4]。THz对肿瘤细胞有怎样的影响目前尚未见相关报道。本实验采用体外培养小鼠肺癌细胞(Lewis细胞)，研究其被THz辐射后的增殖、生长情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器 Lewis细胞(我院谢斌教授惠赠，引自ATCC，编号36470TM)；胎牛血清(Gibco公司产品)；高糖DMEM培养基(Gibco公司产品)；四甲基偶氮唑盐(MTT)、Trypan blue(台盼蓝)试剂及Hoechst 33342荧光剂(碧云天公司产品)；752分光光度计为上海医用分析仪器厂的产品；荧光显微镜为OLYMPUS公司产品。

太赫兹波辐射仪(上海康乾医疗科技有限公司)，本仪器是由复旦大学、中国科学院深圳先进技术研究院费伦教授团队研发的太赫兹波辐射仪，可调控太赫兹波发射强度，拥有专利技术(专利号：ZL032311672)。太赫兹波辐射仪基本参数如下：功率：AV25W，外部可更换保险丝为：Φ5×20mm F 0.5A 250V，重量：2 100g，外形尺寸：280mm×240mm×90mm，工作条件：15～40℃，相对湿度<80%，工作温度：高档：(40±3)℃；低档：(33±3)℃，电源电压的适用范围：交流～220V 50Hz或60Hz，定时范围[(5～60)±2]min，储存条件：-40～55℃，相对湿度<93%，辐射头 16只，辐射头固定托 16只，电源线1根。

1.2 细胞培养及太赫兹波辐射干预 Lewis细胞复苏后用含10%胎牛血清DMEM(高糖)培养液于37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱内培养。当培养瓶内细胞长满至85%时，用0.125%的胰酶消化，进行传代培养，每3d换液传代1次。

将生长良好的Lewis细胞分成正常对照组、THz低辐射组(相当能量10meV级)、THz中辐射(100meV)组、THz高辐射(300meV)组。各THz辐射组的细胞于传代培养第2天开始，每天上午9点和下午3点分别接受相应剂量的THz辐射(每次辐射30min，2次/d)，共3d。

1.3 细胞增殖抑制率测定(MTT法) 本实验每组设10个复孔，实验重复10次，同时配以空白组(仅加培养液)。到时间点后，96孔培养板的各孔加入MTT液20μl/孔，4h后终止培养，弃去上清，加入DMSO(100μl/孔)，振荡使结晶物溶解，用自动酶标仪波长570nm处测吸光度值(D570)，计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%。

1.4 Trypan blue染色细胞直接计数法 Trypan blue是一种具有阳离子特性的染料，活细胞拒染，死细胞被染成蓝色。实验结束后，以1∶4的比例加入0.4%台盼兰使其终浓度为0.1%，染色1min后将长有神经细胞的盖玻片反盖在载玻片上，5min之内在光学显微镜下计数死细胞及活细胞数。随机计数200个细胞以上，计算死细胞率(%)=死细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。实验重复10次。

1.5 Hoechst33342荧光染色检测 本实验每组设10个复孔，实验重复10次。到时间点后，各孔加入终浓度为10μg/ml的Hoechst33342并于37℃孵育30min，再加入终浓度为1%的多聚甲醛于暗处固定细胞30min。暗处离心弃上清，取细胞涂片并用封片液封片于载玻片上。荧光显微镜下观察结果。在高倍镜下随机计数200个细胞并照相。计算凋亡率：凋亡率(%) = 凋亡细胞数/计数的细胞总数×100%。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 正常对照组的Lewis细胞生长良好，贴壁好，细胞密集，胞体透亮。THz低辐射对细胞生长影响不明显，状态良好，培养体系中死细胞极少；随着THz辐射量加大，中、高剂量组的细胞生长状态欠佳，数量增加缓慢，部分细胞皱缩，培养体系中悬浮少量死细胞，以THz高剂量组更明显(图1)。

图1 THz对 Lewis细胞的影响(×400)

2.2 MTT检测结果 THz低辐射组D值与正常对照组接近，说明THz低辐射对Lewis细胞无明显抑制作用。THz中、高辐射两组的D值明显低于正常对照组D值(P<0.01)，表明增大THz辐射量能抑制细胞增殖。见表1。

表1 THz辐射对Lewis细胞生长抑制作用

2.3 Trypan blue染色计数结果 THz辐射实验结束后，经Trypan blue染色，正常对照组及THz低辐射组的死细胞数量少，两组间比较无统计学差异(P>0.05)。THz中、高辐射两组的死细胞增多，且THz高辐射组更明显；THz中、高辐射组分别与正常对照组比较，均有统计学差异(P<0.01)。见表2。

表2 THz辐射对Lewis细胞生长的影响

2.4 Hoechst33342荧光检测结果 Hoechst33342是特异性DNA染料，能透过细胞膜与DNA上A-T键结合，在紫外线激发下发出蓝色荧光，根据细胞核的形态、染色质状态及荧光强度做判断。荧光显微镜下，活细胞的核呈弥散均匀荧光；凋亡细胞的核或细胞质内可见浓染致密的颗粒、块状荧光，如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞。 正常对照组及THz低辐射组仅见微量的凋亡细胞，两组间比较无统计学差异(P>0.05)。THz中、高辐射两组的细胞凋亡率升高，分别与正常对照组比较，均有统计学差异(P<0.01)，这表明THz辐射也可诱导Lewis细胞凋亡。见表2、图2。

图2 THz对 Lewis细胞影响的荧光图(×400)

3 讨论

研究发现生物大分子间的信息应答、精确调控对生物分子集体振动模式引起的分子构象、分子结构及分子环境等变化都非常敏感。许多化合物分子内振动模式的频率对应于THz范围，比如氢键作用力、范德瓦尔斯力、偶极—偶极作用力、晶格振动和一些分子内集体骨架振动等[1]。但THz对肿瘤细胞的影响尚未见报道，故了解THz对肿瘤细胞的影响具有较强的科学意义。

本实验采用体外培养Lewis细胞，研究其被THz辐射后的增殖、生长及凋亡等影响。结果发现THz低辐射对Lewis细胞生长、增殖几乎无影响；THz中、高辐射能明显抑制Lewis细胞生长、增殖，且高辐射更明显。此外THz中、高辐射也能诱导Lewis细胞凋亡，故THz中、高辐射诱导Lewis细胞凋亡是其抑制Lewis细胞生长、增殖的机制之一。陈中等[5]采用类似的研究方法，即运用不同剂量的THz辐射K562细胞(人白血病细胞)，亦发现相当于中、高剂量THz能明显抑制细胞存活；结合本研究结果，可提示THz具有较好的抑制肿瘤细胞存活、抗肿瘤细胞增殖的作用。从THz诱导Lewis细胞凋亡效果来看，以中辐射诱导效果更好，高辐射效果反而下降，笔者推测其原因可能THz高辐射会引起细坏死，这可为THz技术治疗肿瘤提供了思路。

因RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空间构象、振动能级和氢键能等都处于THz段，如核苷酸链的振动模式转变成为结构振动模式，碱基对以集体振动为主[2-4]，故笔者推测THz也影响了肿瘤细胞的分子构象、分子结构、分子间作用力等，从而影响了Lewis细胞的生长、增殖。但THz对生物大分子的空间构象、振动能级和氢键能等有何具体影响有待深入研究。另外，有研究报道，太赫兹波辐射对小鼠后，可影响其造血功能，能增加小鼠血液中红细胞、血红蛋白的含量，可刺激骨髓细胞粒单系克隆形成[6]。因此，笔者推测Lewis细胞的氢键能、分子间作用力等生物结构与正常细胞有不同，这可能是今后抗肿瘤方向新的突破口，其详细机制有待深入研究。