玉米秸秆预水解液中半纤维素的酯化改性及其生物活性研究

陈 琳， 刘海棠,2,3

（1.中国轻工业造纸与生物质精炼重点实验室，天津市制浆造纸重点实验室，天津科技大学轻工科学与工程学院，天津 300457；2.江苏省生物质能源与材料重点实验室，南京 210042；3.天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 300457）

中国秸秆种类主要为水稻、小麦、玉米等。2017年我国的秸秆可收集资源量为约7亿t，其中玉米秸秆资源量最大，约为2.43亿t[1-2]。据报道，大约有一半以上的玉米秸秆因为收集和运输不便而被直接丢弃或焚烧，无法得到充分利用[3]，这不仅是对资源的浪费，同时也污染了环境。因此，寻找更加高效绿色的玉米秸秆处理技术对减缓环境污染和能源紧缺等状况具有重要意义[4]。

玉米秸秆作为制浆原料时，主要被应用的是其中的纤维素，半纤维素及木质素则随着废液排放被浪费掉。近些年，半纤维素由于结构的多样性在很多领域得到应用，因而受到人们的关注。玉米秸秆预水解液的主要成分为木质素和半纤维素，提取纯化其中的半纤维素，并进行改性应用研究，能够提高生物质资源的利用率，减少环境污染。

半纤维素是由两种或两种以上的聚糖相互交织在一起形成的一类物质的总称，不同植物种类的半纤维素组分和含量是完全不一样的。近年来，半纤维素(低聚木糖)在生物和医药行业的潜力逐渐被人们发掘出来，利用半纤维素无毒、抗微生物等优点，可以在血浆代用品、活性疫苗和控制药物释放载体等方面进行应用[5-6]。在食品生产中，半纤维素可以作为食品中的黏合剂、增稠剂使用。

对羟基苯甲酸酯是一种被添加于化妆品、药品、食品中的防腐剂，其具有优良的抑菌特性，对革兰氏阳性菌、酵母菌、霉菌具有较强的抑制作用。但是，有研究发现对羟基苯甲酸酯有雌激素效应，同时对羟基苯甲酸酯对人类皮肤有轻微的刺激性。因此，如能寻求一种无污染、无毒性的防腐剂取代物将是一个技术飞跃[7]。

本论文以从玉米秸秆预水解液中提取的半纤维素为原料，加入一定量的对羟基苯甲酸于均相介质N，N-二甲基乙酰胺/氯化锂体系中，通过不同条件下的改性处理，以获得理想取代度的半纤维素酯，并探究了其反应机理和抗氧化性、保湿性、吸湿性。

1 实验

1.1 原料与试剂

玉米秸秆预水解液，山东五小征生态农业科技有限公司。硫酸、无水乙醇、氢氧化钠、对羟基苯甲酸、无水氯化锂、二甲基乙酰胺、吡啶、酚酞、DPPH、硫酸铵、碳酸钠、五氧化二磷，均为分析纯，溴化钾为色谱纯，购于天津市康科德科技有限公司。D-(+)-葡萄糖、L-(+)-阿拉伯糖、D-(+)-木糖，均为色谱纯，购于Sigma公司。

1.2 实验设备

YA28X-4T型立式压力蒸汽灭菌器、HHS-21-4型电热恒温水浴锅，上海博讯有限公司；VOS-60A型真空干燥箱，上海施都凯仪器设备公司；DKM610C型电热鼓风干燥箱，日本雅马拓公司；SHB-III型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸易有限司；N-1100型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限司；1200 series型高效液相色谱仪，德国爱捷伦公司；FTIR-650型傅里叶红外光谱分析仪，天津港东科技发展股份有限公司；RH basic型磁力搅拌器，德国IKA公司；Q50型热重分析仪，美国TA公司；AR2140型电子天平、STARTER3100型酸度计，奥豪斯仪器（常州）有限公司；XRD-6100型X射线衍射仪，日本岛津公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 半纤维素的提取

取适量的玉米秸秆预水解液于1000 mL烧杯中，用质量分数为72%的浓硫酸调节预水解液pH值为1.7左右。然后，将调节好pH的预水解液置于45℃恒温水浴中，水浴30～45 min，使预水解液中的木素可以较完全地沉淀。待预水解液冷却至室温后，对其进行抽滤，除去底部沉淀物（主要成分为木素），得到透明且无悬浮物的滤液。加入体积为滤液体积3倍的无水乙醇，静置24 h以上，出现明显分层，再次将其抽滤，用无水乙醇洗涤抽滤后的滤渣3次，然后将滤渣置于真空干燥箱中（12 h，40℃），得到的粉末状固体即为半纤维素。

1.3.2 对羟基苯甲酸半纤维素酯的合成

取适量的对羟基苯甲酸粉末，置于200 mL烧杯中，加入一定量的上述过程中提取得到的半纤维素，反应在均相介质N，N-二甲基乙酰胺/氯化锂体系中进行，用5 mL吡啶作为催化剂，75℃下反应30 min，反应结束后，冷却至室温，加入3倍体积的无水乙醇于反应混合物中，充分搅拌，待沉淀完全后离心，将得到的沉淀物用无水乙醇洗涤3次，真空干燥至衡重，所得到的固体即为对羟基苯甲酸半纤维素酯[8]。

1.4 半纤维素中的单糖组分分析

采用两步酸水解法对制取的半纤维素样品进行处理，然后利用高效液相色谱法进行检测分析。

准确称取0.5 g半纤维素样品于小烧杯中，并加入3 mL 72%的浓硫酸，混合均匀，放入30℃恒温水浴锅中水浴加热1 h，然后将经浓硫酸水解后的样品转移到100 mL锥形瓶之中，用超纯水冲洗小烧杯，将洗液转移到锥形瓶中，前后超纯水体积共约84 mL，这样就可将72%的浓硫酸稀释成为4%的稀硫酸。然后，使用锡箔纸封住锥形瓶的瓶口，再使用牛皮纸封住锥形瓶的瓶口，将锥形瓶放入蒸汽灭菌锅中，蒸汽灭菌锅的温度设置为121℃，45 min后将锥形瓶从蒸汽锅中取出，待锥形瓶中的试样冷却至室温后，使用一次性针管注射器移取试样于液相小瓶之中，同时使用水系滤膜滤去试样中可能存在的滤渣。随后，把液相瓶放入高效液相色谱仪中进行检测。

1.5 半纤维素中的酸溶木素含量测定

取一部分上述两步酸水解法得到的溶液，用0.45 μm的滤膜过滤除去不溶物，将滤液用紫外分光光度计在205 nm处测量其吸光度。半纤维素中酸溶木素的含量可以根据式（1）计算[9]。

式中：ε为吸收系数，取110 L/（g·cm）；D为稀释倍数；A为吸光度；L为比色皿厚度，一般为1 cm；ω为木素含量，g/L。

1.6 对羟基苯甲酸半纤维素酯的取代度测定

称取0.2 g对羟基苯甲酸半纤维素酯于250 mL烧杯中，加入80 mL质量分数为75%的乙醇溶液，待其溶解后，加入40 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，充分搅拌20 min后静置，然后用4%硫酸标准溶液进行滴定，以酚酞作为指示剂。溶液由红色刚刚变为无色时，滴定终止，并记录此时消耗的硫酸标准溶液的体积。此外，在酯化过程中，对羟基苯甲酸半纤维素酯会发生少量的降解而消耗微量的碱，因而需用制备的半纤维素作为空白样品进行滴定。对羟基苯甲酸半纤维素酯的取代度（DS）根据式（2）计算。

式中：nz为每克样品所含酯基的量，mmol；V为样品与空白样品所用的硫酸标准滴定溶液的体积值之差，mL；c为硫酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；m为试样的质量（以木糖计），g。

1.7 红外光谱（FTIR）表征

用傅里叶红外光谱仪对对羟基苯甲酸半纤维素酯进行结构分析。将待测的对羟基苯甲酸半纤维素酯和溴化钾（KBr）在105℃下烘干4 h。将少量待测样和KBr以m（待测样）∶m（KBr）=1∶100的比例进行充分研磨，压片制样，压力为10 MPa，时间为60 s，扫描范围400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.8 抗氧化性评价

采用测定DPPH自由基清除率的方法[10]对从预水解液中提取的半纤维素及对羟基苯甲酸半纤维素酯进行抗氧化性能评价。

比色法测定DPPH自由基清除率的原理主要是，DPPH自由基上的孤对电子与自由基清除剂提供的一个电子配对，使原本呈紫色的溶液变为黄色，在517 nm处的吸光度发生改变。所以，当向DPPH溶液中加入具有抗氧化性的对羟基苯甲酸半纤维素酯溶液时，半纤维素酯和对羟基苯甲酸上的未取代羟基会与DPPH自由基上的孤对电子配对，从而在517 nm处的吸光度降低，溶液变为黄色[11]。

半纤维素溶液的制备：准确称取40 mg半纤维素，溶解于8 mL蒸馏水中，得到质量浓度为5 mg/mL的半纤维素溶液，再分别将其稀释成0.3125、0.625、1.25、2.5 mg/mL系列质量浓度的半纤维素溶液。分别吸取2 mL不同质量浓度的半纤维素溶液置于试管中，每支试管加入2 mL配制好的0.03 mmol/L DPPH溶液，充分摇匀后室温下避光反应30 min，在517 nm波长处测定各溶液的吸光度，记为Ai；另取2 mL不同质量浓度的半纤维素溶液置于试管中，每支试管加入2 mL的无水乙醇，混匀后避光30 min，在同一波长下测定其吸光度，记为Aj；空白对照：量取2 mL 0.03 mmol/L的DPPH溶液，加入2 mL无水乙醇，混匀后室温避光放置30 min，同一波长下测定其吸光度，记为A0。按照上述实验步骤，用对羟基苯甲酸半纤维素酯代替半纤维素配置不同质量浓度的溶液，其他条件保持不变。DPPH自由基清除率根据式（3）计算。

1.9 吸湿性和保湿性测定

1.9.1 吸湿性

室温下，分别称取0.2 g半纤维素和0.2 g对羟基苯甲酸半纤维素酯各2份，分别放入称量瓶中，将每种样品的2个称量瓶分别放置在不同的干燥器中，一个干燥器内放有饱和的硫酸铵溶液（相对湿度为81%），另一个干燥器内放有饱和的碳酸钠溶液（相对湿度为43%），放置时间为12、24、48 h。称量放置后的质量，根据式（4）计算吸湿率。

式中：m0和m1分别是原样品质量和置于干燥器后的样品质量。

1.9.2 保湿性

5.实习基地的顶岗实习和经验总结。依据人才培养方案，安排、组织最后一学期的实习，将所学理论知识运用于教学实践，实地训练，锻炼能力、积累经验、反思内化。

室温下，分别称取0.2 g半纤维素和0.2 g对羟基苯甲酸半纤维素酯各2份，分别放入称量瓶中，向称量瓶中滴加去离子水（样品质量的10%），称其质量，记为m0。将每种样品的2个称量瓶分别放置在不同的干燥器中，一个干燥器内放有饱和的碳酸钠溶液（相对湿度为43%），另一个干燥器内放置干硅胶（相对湿度为10%），放置时间为12、24、48、72 h。称量放置后的质量m1，根据式（5）计算保湿率。

2 结果与讨论

2.1 半纤维素的提取

表1是pH值对从预水解液中提取半纤维素的影响。由表1可知：pH对半纤维素的提取影响较大，当pH=3时，仅能从预水解液中提取到少量的半纤维素；进一步降低pH=1.7时，半纤维素提取量大幅提高，此时的pH为提取半纤维素的较适宜条件。提取所得的半纤维素为浅黄色，是由于实验条件有限，制取的半纤维素中掺杂一些木素以及其他含发色基团的物质，并未得到纯净的半纤维素。若要获得纯度更高的半纤维素，对此实验步骤及条件还需进一步优化。

表1 pH值对从预水解液中提取半纤维素的影响

2.2 半纤维素的单糖组分

玉米秸秆预水解液中半纤维素的单糖组分见表2。从玉米秸秆预水解液中提取的变性半纤维素的单糖组分主要为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，且木糖含量最高，占68.54%，其次是葡萄糖，含量为28.82%，其中还含有2.64%的阿拉伯糖。综上可以看出，木聚糖是玉米秸秆预水解液中的半纤维素的主要组成。

表2 玉米秸秆预水解液中半纤维素的单糖组分

2.3 半纤维素的木素含量

用紫外分光光度计在205 nm处测量半纤维素酸溶液的吸光度，结果见表3。根据式(1)计算可得木素含量为0.102 8 g/L。

表3 半纤维素酸溶液在205 nm处的吸光度

2.4 对羟基苯甲酸半纤维素酯的取代度

图1是对羟基苯甲酸用量对对羟基苯甲酸半纤维素酯取代度的影响。有图1可以看出：当对羟基苯甲酸与半纤维素物质的量比1时，对羟基苯甲酸半纤维素酯的取代度最大，为0.84；当对羟基苯甲酸与半纤维素物质的量比由0.5增大为1时，取代度增加；继续增加羟基苯甲酸用量，则取代度持续降低。由此可知，在相同的温度和反应时间的条件下，取代度达到一定数值时，继续增加羧酸用量不仅不能增大取代度，反而会导致取代度降低。周慧芳[12]测量了不同半纤维素与肉桂酸比例下半纤维素衍生物的取代度，结果表明，随着肉桂酸用量的增加取代度随之增大，但当达到最大取代度后，继续增加肉桂酸的用量，不仅不会增大或者维持在一个稳定的取代度，反而会导致取代度逐渐降低。这与本实验中取代度数值先增加后降低的规律是相符合的。

图1 对羟基苯甲酸用量对对羟基苯甲酸半纤维素酯取代度的影响

在本实验中，对羟基苯甲酸半纤维素的最佳合成条件为：反应时间30 min，反应温度75℃，对羟基苯甲酸与半纤维素物质的量比为1。此时，对羟基苯甲酸半纤维素的最大取代度为0.84。以下关于对羟基苯甲酸半纤维素的表征及生物活性的探究都采用此条件下的产物。

2.5 红外光谱（FTIR）分析

从图2半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的红外光谱图中可以看出：1123～983 cm-1范围内的吸收峰是木聚糖的典型标志；1196～983 cm-1是C—OH的伸缩振动区间；糖单元上的羟基在3364 cm-1处有特征峰；在2924 cm-1处的吸收峰归属于C—H的伸缩振动；在1745 cm-1处的吸收峰归属于酯基（—COO—）的伸缩振动，表明半纤维素与对羟基苯甲酸已经反应生成对羟基苯甲酸半纤维素酯。

图2 半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的FTIR图谱

2.6 抗氧化性

由图3可以看出：半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯对DPPH自由基都有一定的清除率，且清除率随溶液浓度的增加而提升。当溶液质量浓度为5 mg/mL时，对羟基苯甲酸半纤维素酯对DPPH自由基的清除率达到90.30%，而相同浓度半纤维素对DPPH自由基的清除率只有30.64%,可见对羟基苯甲酸半纤维素酯对DPPH自由基的清除能力大大优于半纤维素，说明对羟基苯甲酸半纤维素酯相比半纤维素具有良好的抗氧化能力。

图3 对羟基苯甲酸半纤维素酯与半纤维素对DPPH自由基的清除作用比较

2.7 吸湿、保湿性

2.7.1 吸湿性

图4是在相对湿度分别为43%和81%的环境中半纤维素、对羟基苯甲酸半纤维素酯的吸湿性。从图4中可以看出：对比两种样品的吸湿性，对羟基苯甲酸半纤维素酯比半纤维素更优异，而且在相对湿度为43%的环境中其吸湿性略强。

图4 半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的吸湿性

2.7.2 保湿性

图5是在不同相对湿度条件下下半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的保湿性。从图5可以看出：对比两种样品的保湿性，在两种湿度环境下，半纤维素的保湿率要比对羟基苯甲酸半纤维素酯下降的幅度大，由此可以得出在本文两种湿度环境下，对羟基苯甲酸半纤维素酯的保湿效果要优于半纤维素；而且，同种样品在10%相对湿度环境下的水分流失要比在43%相对湿度环境下更少一些。

图5 半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的保湿性

根据对半纤维素和对羟基苯甲酸半纤维素酯的吸湿性、保湿性的分析可知，半纤维素酯化有利于改善半纤维素的吸湿性和保湿性，半纤维素酯化产物具有较强的吸湿性和保湿性。

3 结论

本文从玉米预水解液中提取半纤维素，对其进行纯化后，再与对羟基苯甲酸进行酯化反应，制备得到对羟基苯甲酸半纤维素酯。

在实验过程中对羟基苯甲酸半纤维素酯的取代度相对较高，说明反应进行比较完全。在相同浓度条件下，对羟基苯甲酸半纤维素酯的抗氧化性（对DPPH自由基的清除率）优于半纤维素。半纤维素经过酯化改性得到的对羟基苯甲酸半纤维素酯在吸湿性能和保湿性能方面都有明显的提高。综上，对羟基苯甲酸半纤维素酯具有良好的抗氧化性，其吸湿性和保湿性均优于半纤维素，有望在化妆品、食品和药品行业中进一步开发利用。