固相萃取/超高效液相色谱—串联质谱法测定水中7 种大环内酯类抗生素

付晓燕

（辽宁省大连生态环境监测中心，辽宁大连 116023）

1 引言

大环内酯类抗生素（Macrolides Antibiotics，MA）是一类分子结构中具有12-16 碳内酯环的抗菌药物的总称，属于快速抑菌剂［1-2］，主要用于治疗需氧革兰阳性球菌和阴性球菌、某些厌氧菌以及军团菌、支原体、衣原体等感染［3-4］。大环内酯类抗生素被广泛用于医院临床治疗和畜牧养殖业。当前，我国大量生产和使用抗生素，由于缺乏有效的抗生素监管措施，排放的抗生素废水会污染周边水体，对生态环境造成严重影响。国家“十四五”环保规划中要求开展新污染物监测评估与治理，水质抗生素的检测和处理迫在眉睫。

目前抗生素的检测方法主要有TTC 法、气相色谱法、液相色谱法、微生物检测法以及液相色谱—串联质谱法等［5-8］，但针对环境水体中大环内酯类抗生素的检测技术相对较少，相对于液质联用技术，其他检测方法前处理非常复杂，检测灵敏度低，准确度不够，容易出现假阳性结果。为了提高样品抗生素检测的准确性，本研究采用固相萃取（SPE）—液质联用技术，建立了水质大环内酯类抗生素的检测方法，并成功地应用于大连市6 条主要河流地表水中抗生素的分析测定。本方法提高了大环内酯类抗生素分析的准确性和灵敏度，节省了分析时间，为地表水中大环内酯类抗生素污染调查提供了科学依据和技术支撑。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，Waters TQ Detector 新型离子源加热型质谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Milli-Q超纯水器；HLB 固相萃取柱：填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，6 cc/200 mg；0.22 μm 有机相针筒式微孔滤膜过滤器，材质为亲水性聚丙烯，亲水性聚四氟乙烯（PTFE）等。

甲醇与乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma 公司）；实验用水为经Milli-Q 净化系统制备的超纯水（经0.22 μm 过滤膜）；氮气、氩气（纯度≥99.999%）；乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、抗坏血酸（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。6 种大环内酯类抗生素标准品包括罗红霉素（ROX）、替米考星（TIC）、红霉素（ERY）、螺旋霉素（SPM）、阿奇霉素（AT）和泰乐菌素（TYL）；标准物质纯度均≥99%（百灵威公司）。

2.2 色谱条件

ACQUITYUPLCBEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。流速0.2 mL/min，柱温40 ℃，进样量10 μL。

表1 液相色谱流动相线性梯度洗脱程序

2.3 质谱条件

电离方式为电喷雾电离ESI（＋），检测方式为多反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）方式，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果；电喷雾电压3.5 kV；离子源温度120 ℃；去溶剂温度400 ℃。具体质谱分析参数见表2。

表2 7 种大环内酯类抗生素的质谱参数

2.4 样品制备

水样静置，取地表水100 mL 上清液，调节pH至2～3，经0.45 μm 滤膜过滤除去悬浮颗粒物，准确加入250 mg EDTA Na2，采用HLB 固相萃取柱进行萃取。先后用10 mL 甲醇、10 mL 超纯水活化HLB萃取柱。将水样以2～5 mL/min 的流速通过固相萃取柱，上样完毕后，用10 mL 超纯水淋洗小柱，再用氮气吹干小柱，最后用10 mL 甲醇洗脱富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脱液，35 ℃氮吹浓缩至近干，加0.1%甲酸溶液定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤，置于进样瓶中等待进样。

3 结果与讨论

3.1 液相色谱条件的优化

流动相的组成会影响目标化合物的色谱峰形、分离效果及离子化效率。比较了流动相中甲酸浓度对于离子丰度的影响，结果表明，流动相中加入甲酸能够相对增强离子丰度，对大环内酯类抗生素的离子化促进作用非常明显。在该实验中采用了甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水溶液或含0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸水溶液作为流动相，使用同一BEH C18色谱柱，在相同色谱条件下进行梯度洗脱分离，结果表明，0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸水溶液作为流动相的峰形与峰高优于其他流动相，且6 种抗生素分离度更好。

3.2 质谱条件的优化

根据大环内酯类抗生素分子结构中的基团特征和化学电离性质，实验最终选择MRM 模式，ESI（＋）模式进行扫描。为了获得最佳的灵敏度和分离效果，首先采用连续直接进样，扫描质核比（m/z）范围为10～1 000，分别对离子源温度、电喷雾电压、锥孔电压、碰撞电压、去溶剂温度、锥孔气流量等条件进行优化，使调谐液中大环内酯类抗生素的离子化效率达到最佳，最终得到6 种大环内酯类抗生素在MRM模式下的质谱参数

3.3 检出限和标准曲线的线性范围

配制罗红霉素、替米考星、红霉素、脱水红霉素、螺旋霉素、阿奇霉素和泰乐菌素7 种抗生素的混合标准储备液100.0 mg/L，并逐级稀释成浓度分别为2，5，10，20，50，100 μg/L 系列的标准工作液，按样品分析全过程，分析测定进样量10 μL。以所得峰面积对抗生素标准溶液浓度进行回归分析，线性关系良好。校准曲线、线性相关系数、检出限（S/N＝3）、精密度和回收率见表3。

表3 7 种大环内酯类抗生素的线性方程、检出限、精密度和回收率

3.4 精密度和回收率

以经测定不含有大环内酯类抗生素的地表水为基质，添加抗生素样品中浓度为50 ，100 ng/L 2 个不同浓度的标准溶液，按筛选最优的实验条件，每个浓度样品重复测量6 次，分别进行精密度和回收率的测定，测定结果见表3。

4 结论

本文建立了固相萃取/液相色谱—串联质谱法对水中7 种大环内酯类抗生素的快速分析方法，该方法通过HLB 固相萃取柱进行前处理分析，节省了水样前处理过程中需要消耗的大量有机溶剂，并缩短了检测时间，方法检测限低至0.004～0.009 μg/L，分析速度快，操作简便，定性准确，灵敏度高，稳定性好。