核桃内种皮脂质和氨基酸组成分析

谢素雅，曹尚桥，李红波，张小勇，刘振彬，胡梁斌，莫海珍

（1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.中粮工科（西安）国际工程有限公司，陕西 西安 710082）

核桃种植遍布世界各地，我国拥有最大的种植面积和产量。作为重要的坚果树种和木本粮油树种，核桃具有很高的生态效益和经济效益[1]。核桃的全系产业链价值十分可观，但就目前而言，产品的附加值开发程度整体较低。为了提高核桃油的加工品质，在产品加工过程中需要脱掉核桃内种皮（俗称核桃仁囊衣），有助于改善核桃油脂色泽、消除不良风味，但也意味着核桃内种皮在加工过程中被丢弃而造成资源浪费。

核桃的内种皮是包裹在核桃仁表面的一层薄膜，成熟干制后呈金黄色，有苦涩味[2]。中医认为，核桃皮可以入药，也可以泡水。核桃皮的性温、味苦辛，归肝、胆、胃经，有养胃健胃、疏肝卫胆、润通肠胃、治疗顽癣、杀虫止痒的功效，也有一定的补肾润肺、养身补气的功效。有研究表明，核桃内种皮总酚含量和抗氧化能力远高于核桃仁[2-4]。万政敏等人[5]发现核桃内种皮中富含多种酚酸类物质和黄酮类物质，荣瑞芬等人[6]对核桃内种皮的营养及功能成分（蛋白质、碳水化合物、脂肪等）进行了初步分析，结果表明其中含有较丰富的脂肪和蛋白质。但是目前有关研究仅限于含量测定，对于内种皮中氨基酸及脂质组成尚未深入探讨，极大地限制了其产业开发应用及核桃内种皮油脂的深度梯次加工。

以陕西香玲核桃为研究对象，通过分析核桃内种皮中氨基酸的组成、内种皮油脂中脂质成分、脂肪酸及甘油酯的组成，以期为核桃内种皮高值化产品的开发提供理论基础，减少资源浪费。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：香玲核桃，山东省果树所1978年杂交育成的早实，产地为陕西延安。

试验试剂：氯仿、甲醇、浓硫酸、氯化钠、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）均为分析纯，天津天力化学试剂有限公司提供；正己烷、甲醇均为色谱纯，天津科密欧化学试剂厂提供。

1.2 仪器与设备

KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；MD200-1型氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司产品；JA2003N型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品；FW-100D型高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司产品；RE100-Pro型冷冻干燥机，四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司产品；RE100-Pro型旋转蒸发仪，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司产品；GC-MS 6800型气相色谱质谱联用仪，江苏天瑞仪器股份有限公司产品；LCMSMS液 质 联 用 仪 （Q Exactive Orbitrap LCMSMS），赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；高效液相色谱仪，滕州市滕海分析仪器有限公司产品；HH-S6L型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

核桃去壳置于沸水中浸泡一段时间后去皮处理，收集核桃内种皮装入密封袋放入-80℃冰箱中备用。

1.3.2 蛋白质、脂肪含量测定

蛋白质参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的方法进行测定，脂肪参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》的方法测定。

1.3.3 氨基酸组成测定

氨基酸组成的测定参照《HRZ/ZDS-GF-015-2020饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法》。

1.3.4 核桃内种皮油脂的提取

油脂提取采用Folch J等人[7]的方法稍作修改，将核桃内种皮粉碎后冷冻干燥，溶剂以氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.75（V/V/V）的比例，样品和溶剂以1∶15的比例进行制备，其中加入0.005%的BHT做抗氧化处理，超声波（40 kHz，100 W）辅助萃取20 min，温度设置为30℃，静置分层后真空抽滤，去除样品残渣后倒入分液漏斗静置，收集下层溶液进行旋蒸，旋转蒸发仪温度设置40℃，每种样品重复3次萃取，旋蒸后还残存的有机溶剂用氮吹仪辅助去除得到核桃仁种皮油脂。

1.3.5 脂质组成测定

将100 μL样品加入到有聚四氟乙烯衬里帽的玻璃离心管中，加入0.75 mL预冷的甲醇，涡旋振荡。加入2.5 mL预冷的甲基叔丁基醚，在摇床上室温孵育1 h加入0.625 mL质谱级水混匀，使有机相分层，室温孵育10 min后，以转速1 000 r/min离心10 min。收集上层有机相，向下层（水和甲醇）加入1 mL混合溶剂（甲基叔丁基醚/甲醇/水（10∶3∶25，V/V/V））再次萃取，收集上层有机相。将2次收集的有机相用氮吹仪进行氮吹浓缩。用100 μL混合溶剂异丙醇进行复溶，之后用LC-MS/MS系统检测分析，从每个已处理好的样本中取等量上清液混匀作为QC样本。色谱分析条件：色谱柱Thermo Accucore C30；柱温40℃；流速为0.35 mL/min；进样量5 μL；流动相A：（乙腈∶水=60∶40）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵；流动相B：（异丙醇∶乙腈=90∶10）+0.1%甲酸+10 mmol/L乙酸铵。质谱分析条件：正负离子模式下：鞘气，20个任意单位；扫描气体，1任意单位；辅助气量，5（负离子：7）；喷雾电压，3 kV；毛细管温度，350℃；加热温度，400℃；S-透镜射频水平，50；扫描范围，114～1 700 m/z；自动增益控制目标，1e6；标准化碰撞能量，25、30（负离子，20、24、28）；注入时间，100 ms；隔离窗口，1 m/z；自动增益控制目标（MS2），1e5；动态排除，15 s。

1.3.6 脂肪酸组成测定

脂肪酸甲酯化：取20 μL油脂样品放入具塞试管，加入1%的硫酸甲醇溶液1.5 mL，于80℃水浴锅中水浴1 h，期间不时摇晃试管，水浴后依次加入饱和的NaCl溶液1 mL，去离子水1 mL，色谱纯正己烷2 mL，静置分层后从上层吸取750 μL放至进样瓶进行GC-MS分析。检测脂肪酸甲酯使用安捷伦7000D三重四极杆GC-MS仪进行分析。配有Agilent DB-23型色谱柱（内径30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。所有测量在全扫描模式下（50～500 m/z）执行以下程序：初始温度为130℃，保温时间为1 min，然后以5℃/min上升至230℃，最终温度为230℃，保温5 min，总运行时间为26 min。采用自动进样器分流（1∶20），进样量为1 μL。

1.3.7 甘油酯组成测定

采用高效液相色谱（NP-HPLC，折射率检测器）对甘油酯进行分析，HPLC仪器分析条件：Phenomenex Luna硅胶柱（内径250 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相为正己烷、2-丙醇和甲酸（21∶1∶0.003，V/V/V），流速1 mL/min；柱温30℃；进样体积为10 μL；每个样品检测时间为45 min。

1.4 数据分析

试验所有数据均重复3次，数据运用利用EXCEL 2003、Origin 8.5来绘制图形，SPSS软件进行方差及显著性分析。

2 结果与分析

2.1 核桃内种皮的蛋白质、脂肪分析

核桃内种皮与核桃仁蛋白质、脂肪含量对比（100 g干质量）见表1。

表1 核桃内种皮与核桃仁蛋白质、脂肪含量对比（100 g干质量）/g

和文献[8]中报道的核桃仁营养成分比较，内种皮中蛋白质的含量相对较高，约为13.94%，比一般核桃仁中的蛋白质高出3.85 g/100 g；而脂肪含量相对较少，比一般核桃仁中的脂肪少约41.55 g/100 g。蛋白质含量是企业收购核桃原料时主要考量因素之一[9]。可以看出，核桃内种皮中富含较高的蛋白，具有一定利用价值。

2.2 核桃内种皮的氨基酸组成分析

通过HPLC发现核桃内种皮中富含16种氨基酸，包含7种必需氨基酸和9种非必需氨基酸。

核桃内种皮氨基酸组成及含量见表2。

由表2可以看出，核桃内种皮的总氨基酸（TAA）含量为77.96 mg/g，其中必需氨基酸（EAA）含量为25.85 mg/g，占比33.16%；非必需氨基酸（NEAA）含量为52.11 mg/g。必需氨基酸中亮氨酸的含量最高，达到6.13 mg/g，甲硫氨酸的含量最低，仅有0.84 mg/g；非必需氨基酸中谷氨酸（13.98 mg/g）和精氨酸（8.87 mg/g）的含量较高，胱氨酸的含量最低，为0.78 mg/g。必需氨基酸中的亮氨酸是复配氨基酸静脉注射液的重要成分，对维持危重病人的营养需求有着积极的作用，同时亮氨酸在调节氨基酸和蛋白质代谢等方面也有重要作用；苯丙氨酸是氨基酸类抗癌药物的中间体，也是生产肾上腺素、甲状腺素和黑色素的原料。非必需氨基酸中的谷氨酸是鲜味氨基酸，在促进红细胞生成、改善脑细胞营养及活跃思维等方面发挥重要作用[10]。核桃内种皮中氨基酸的含量及种类十分丰富，具有较大的开发应用潜力。

表2 核桃内种皮氨基酸组成及含量

2.3 核桃内种皮的脂质组成分析

通过液相二级质谱LC-MS/MS对核桃内种皮脂质组成进行分析研究，发现在正负离子模式下核桃内种皮共检测出了10类甘油磷脂（PC，PE，PS，PEtOH，PMeOH，HBMP，PG，PI，PA，CL）、3类鞘脂（SM，Cer，GlcCer）、4类甘油酯（AcylGlcADG，GlcADG，DAG，TAG）、2类糖脂（MGDG，SQDG）、1类脂肪酰，共451种脂质代谢物。

甘油磷脂类有232种，其中包含磷脂酰胆碱（PC）96种、磷脂酰乙醇胺（PE）58种、磷脂酰丝氨酸（PS）11种、磷脂酰乙醇（PEtOH）1种、磷脂酰甲醇（PMeOH）1种、半双（单酰基）甘油磷酸酯（HBMP）12种、磷脂酰甘油（PG）14种、磷酯酰肌醇（PI）18种、磷脂酸（PA）20种、心磷脂（CL）1种，测定结果显示PC、PE的含量比较丰富。检测出的96个PC分子种，其主要种类为17∶1/17∶1和18∶2/18∶2。

核桃内种皮甘油磷脂类PC分子种相对定量分析结果见表3。

由表3可知，检测出的58种PE分子种的主要种类为16∶0/17∶1。PC、PE是细胞膜中最丰富的磷脂，其合成底物为三磷酸胞苷（CTP），可用于激活代谢物。机体组织中PC、PE含量的变化与代谢紊乱（如动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和肥胖）有关[11]。

表3 核桃内种皮甘油磷脂类（PC）分子种相对定量分析结果

核桃内种皮甘油磷脂类PE分子种相对定量分析结果见表4。

表4 核桃内种皮甘油磷脂类（PE）分子种相对定量分析结果

鞘脂类共有77种，其中包含22种鞘磷脂

（SM），34种神经酰胺（Cer），21种葡萄糖神经酰胺（GlcCer）。鞘脂类（SM）的含量比较丰富，检测出鞘磷脂的主要种类为15∶1/27∶1以及23∶1/13∶0。鞘磷脂是具有潜在的抑癌作用的一种脂类，与人体内的胆固醇、脂肪酸、毒枝菌素所引起的疾病有密切关系，已发现了鞘磷脂在一定程度上能够预防动物的结肠癌与动脉硬化的形成[12]。甘油酯类共有132种，其中包含8种酰基葡萄糖醛酸基二酰甘油（Acyl-GlcADG），12种葡萄糖醛酸基二酰甘油（GlcADG），11种二酰甘油（DAG），101种三酰甘油（TAG）。糖脂类共有9种，其中包含7种单半乳糖二酰甘油酯（MGDG）和2种硫代异鼠李糖甘油二酯（SQDG）。脂肪酰类仅检测出一种羟基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA），其种类为18∶1/18∶1。

核桃内种皮鞘脂类（SM）分子种相对定量分析结果见表5。

表5 核桃内种皮鞘脂类（SM）分子种相对定量分析结果

2.4 核桃内种皮的脂肪酸组成分析

通过GC-MS对核桃内种皮脂肪酸组成进行分析，结果见表4。核桃内种皮中饱和脂肪酸总含量为9.39%，其中棕榈酸含量6.43%，硬脂酸含量为2.7%，豆蔻酸和十五烷酸的含量最低，仅为0.03%。单不饱和脂肪酸含量达23.28%，其中油酸含量高达23%，棕榈油酸含量为0.08%。核桃内种皮中含有丰富的多不饱和脂肪酸，含量高达66.4%，其中亚油酸含量占51.9%，α-亚麻酸含量占14.5%。

不少研究发现，不饱和脂肪酸在降低胆固醇，预防、缓解心脑血管疾病、糖尿病和肥胖症方面具有重要的功效，既可以作为辅助治疗血栓的药物，也可作为高级食用油，同时又可以开发成保健产品[13-14]。单不饱和脂肪酸对降胆固醇和降血糖都有明显的作用，油酸不仅可以保护动脉免受损伤，而且对人体的循环系统也具有一定的保护功能[15-16]。多不饱和脂肪酸对癌细胞有毒性作用[17]。亚油酸能抑制胆固醇在小肠中的吸收，促进肝脏内胆固醇的降解和排除，改变体内胆固醇的分布，预防动脉硬化[18-20]。亚麻酸是机体的必需脂肪酸，在降低血脂血压、抗血栓、改善心血管疾病、提高记忆力、保护神经组织、预防过敏性疾病、抑制肿瘤细胞转移、延缓衰老等方面具有重要的生理学功能[19，21-22]。核桃内种皮富含油酸、必需脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸，因此可以将其加工成高级食用油满足消费者的饮食需求，也可以用来开发成新型保健产品、辅助治疗相关病症的药物。

核桃内种皮脂肪酸组成及含量见表6。

表6 核桃内种皮脂肪酸组成及含量

2.5 核桃内种皮的甘油酯组成分析

通过HPLC检测发现核桃内种皮中甘油二酯（DAG）含量为2.93%，其中1,3-甘油二酯含量为0.26%，1,2-甘油二酯含量为2.67%。甘油三酯（TAG）含量达到96.96%，游离脂肪酸（FFA）含量为0.11%。DAG是公认安全的食品成分，有研究表明，DAG具有减少内脏脂肪、抑制体重增加、降低血脂的作用。

核桃内种皮脂肪酸组成及含量见表7。

表7 核桃内种皮脂肪酸组成及含量

3 结论

对陕西香玲核桃内种皮的氨基酸组成及油脂中的脂质分子、脂肪酸和甘油酯组成进行综合分析，结果表明核桃内种皮中蛋白质和脂肪含量分别为13.94 g/100 g和19.06 g/100 g；氨基酸种类丰富，包括7种必需氨基酸和9种非必需氨基酸，其中谷氨酸含量达到13.98 mg/g；内种皮油脂中鉴定出甘油磷脂类、鞘脂类、甘油酯类、糖脂类及脂肪酰类共451种脂质分子，其中PC、PE、SM及ADG相对含量较高；油脂中不饱和脂肪酸含量高达89.69%，其中油酸、亚油酸、α-亚麻酸含量最高；甘油三酯含量达到96.96%并含有少量的甘油二酯（2.93%）。核桃内种皮具有较高的营养价值和保健价值，可能为核桃内种皮的高值化利用提供理论基础，减少资源浪费。