AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中的表达及作用机制研究

陶维平 李琴 李湘胜

喉癌是发生于喉部的疾病，是临床较常见的头颈部恶性肿瘤，主要症状为声嘶、咳嗽、吞咽及呼吸困难等[1,2]。流行病学调查显示，我国喉癌的发病率有明显的地域、性别差异，中老年人群患病率较高，且男性高于女性[3]。由于喉癌临床早期阶段无特异性症状，导致喉癌的早期诊断率较低，随着病情的恶化，严重影响患者预后[4]。因此，及早诊断并治疗对改善喉癌患者病情及预后具有重要价值。据有关调查显示，喉癌与水通道蛋白1(AQP1)、微小RNA-3195(miR-3195)、PINCH-1表达存在相关性[5]。AQP1属于水通道蛋白家族，在血管内皮表达广泛，在肿瘤的生长、浸润、侵袭中有重要作用；miR-3195属于微小RNA家族，可调控细胞增殖、凋亡；PINCH-1属于LIM家族，可参与信号转导、调节细胞形态等生物学功能[6,7]。本研究对喉癌患者癌组织进行手术切除，对癌组织标本中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达进行检测，旨在探究其变化与喉癌病理特征之间的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年5月至2020年11月于我院进行手术治疗的喉癌患者81例，男62例，女19例；年龄53.0～65.0岁，平均年龄(59.0±4.8)岁；其中癌组织分化程度：中低分化60例，高分化20例；肿瘤浸润深度：T1～T2期54例，T3～T4期27例；TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期38例；淋巴结转移情况：有转移25例，无转移56例。本研究获得我院伦理委员会审批通过。

1.2 纳入与排除标准 (1)纳入标准：均符合喉癌诊断标准[8]，均为病理学首次确诊，未接受过其他抗肿瘤治疗，病历资料齐全，所有患者对本研究知情并签署同意书。(2)排除标准：患复发性喉癌者；喉癌癌前病变者；合并严重代谢类疾病者；有手术禁忌证者；合并其他恶性肿瘤者；合并严重感染性疾病者；患精神疾病者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集、免疫组化染色：收取所有喉癌患者手术切除的癌组织、距离癌组织4 cm的癌旁组织制作组织标本，-45℃冰箱冻存待用。取冻存的癌组织、癌旁组织置于甲醛溶液中固定24 h，流水冲洗30 min，不同浓度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。连续切4 μm 薄片，温水烫平，置于载玻片上，恒温箱烘干，二甲苯脱蜡，无水乙醇脱去二甲苯，乙醇脱水，蒸馏水清洗，枸橼酸缓冲液浸泡修复15 min，PBS洗涤液清洗，加POD阻断剂，37℃温育30 min，PBS洗涤液清洗，加山羊血清，室温培育30 min，加一抗，孵育过夜，PBS洗涤液清洗，加二抗，常温孵育30 min，清洗，加DAB显色剂，PBS洗涤液清洗，苏木精复染5 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30 s，氨水反蓝，蒸馏水清洗，伊红染色2 min，乙醇脱水，中性树胶封片，光学显微镜(深圳市博视达光学仪器有限公司，型号：BD-F1A)下观察。

1.3.2 荧光定量PCR检测AQP1、miR-3195、PINCH-1表达：取冻存的喉癌组织及癌旁组织，剪刀灭菌后剪碎，置于匀浆器中，加RNAiso Plus溶液，水浴裂解至无颗粒透明状，移入EP管，室温静置5 min，加氯仿，剧烈震荡均匀，室温静置5 min，5℃高速离心10 min，将上层水相移入新EP管，加异丙醇，静置，5℃高速离心5 min，弃上清液，室温干燥，加DEPC，缓慢吹打至RNA沉淀，提取细胞总RNA，逆转录试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)获得cRNA，Primer5.0软件设计引物，PRC扩增条件：95℃ 3 min预变性，95℃ 30 s，60℃ 4min，75℃ 20 s，重复35个循环；75℃终末延伸5 min。2-△△Ct法计算AQP1、miR-3195、PINCH-1表达。

2 结果

2.1 喉癌患者癌组织、癌旁组织中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达比较 喉癌患者癌组织中AQP1、PINCH-1表达高于癌旁组织，miR-3195表达低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1，2。

表1 癌组织、癌旁组织中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达比较

图1 癌旁组织中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达(免疫组化染色)

图2 癌组织中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达(免疫组化染色)

2.2 不同病理特征患者AQP1、miR-3195、PINCH-1表达比较 中低分化程度患者AQP1、PINCH-1表达高于高分化程度患者，miR-3195表达低于高分化程度患者(P<0.05)；肿瘤浸润深度为T1～T2期患者AQP1、PINCH-1表达低于T3～T4期患者，miR-3195表达高于T3～T4期患者(P<0.05)；TMN分期为Ⅰ～Ⅱ期患者AQP1、PINCH-1表达低于Ⅲ～Ⅳ患者，miR-3195表达高于Ⅲ～Ⅳ患者(P<0.05)，淋巴结转移患者AQP1、PINCH-1表达高于淋巴结未转移患者，miR-3195表达低于淋巴结未转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同病理特征患者AQP1、miR-3195、PINCH-1表达比较

2.3 AQP1、miR-3195、PINCH-1单一及联合检测对喉癌的预测价值 与AQP1、miR-3195、PINCH-1单一检测比较，AQP1、miR-3195、PINCH-1联合检测对喉癌的预测价值较高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 AQP1、miR-3195、PINCH-1单一及联合诊断喉癌的ROC曲线图

表3 AQP1、miR-3195、PINCH-1单一及联合检测对喉癌的预测价值

2.4 AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中的相关性分析 使用Pearson对AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中相关性分析发现，AQP1、miR-3195呈负相关(r=-0.476；P=0.001)；AQP1、PINCH-1呈负相关(r=-0.645；P=0.001)；miR-3195、PINCH-1呈正相关(r=0.523；P=0.001)。见图4。

图4 喉癌癌组织中AQP1、miR-3195、PINCH-1表达相关性

3 讨论

据相关调查显示，喉癌在我国头颈部恶性肿瘤中位列第二位，近年来发病率不断升高，且有年轻化趋势[9,10]。临床主要治疗手段有手术、化疗、基因治疗等，晚期治疗效果不理想，因此，及早发现并治疗用以提高患者预后具有重要价值[11,12]。

AQP1可介导水分子跨膜运动，在肿瘤的迁徙、血管形成中具有重要价值[13]。研究发现，中晚期喉癌患者中AQP1、斯钙素-1(SCT-1)表达较高，且分化程度、肿瘤分期等于AQP1、SCT-1表达密切相关[14]，与本文研究结果一致。喉癌患者癌组织中AQP1表达较高，且随着肿瘤恶化程度增加而上升，可能是AQP1可增加肿瘤血管的通透性，促使水在肿瘤细胞间转运加速，加速肿瘤血管生成，从而加速肿瘤恶化[15]。本研究显示，AQP1可能参与喉癌的发生发展。本文研究还发现，AQP1表达与癌组织分化程度、肿瘤浸润深度、TMN分期、淋巴结转移情况等密切相关，可参与喉癌的发生演进过程。

miR-3195位于20号染色体q13.33，与造血系统肿瘤密切关系，可调控细胞的生长、侵袭等[16]。有研究结果发现，喉癌患者癌组织中miR-3195表达降低，可能与miR-3195可靶向调控ST3GAL2的表达，参与喉癌的发生发展相关[17]。大量研究显示，miR-3195可通过TBX1靶向抑制喉癌细胞Hep-2的增殖，miR-3195低表达导致抑制喉癌细胞Hep-2的增殖减弱，miR-3195有作为喉癌潜在的治疗靶点[18]。本研究显示，喉癌癌组织中miR-3195表达较低，且miR-3195表达在中低分化、肿瘤浸润T3～T4期、TMN分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的喉癌患者癌组织中表达相对较低，说明miR-3195表达与癌组织分化程度、肿瘤浸润深度、TMN分期、淋巴结转移情况等病理特征存在密切相关。

PINCH-1位于2q123-13染色体，在整合素、生长因子信号等传导中有重要的连接作用，在肿瘤的发生、发展中有重要作用[19]。有学者研究认为，PINCH-1在喉癌患者癌组织中表达较高，PINCH-1表达与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况显著相关，肿瘤浸润深度(T3～T4期)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、PINCH-1高表达是喉癌患者危险因素，可影响患者预后[20]，亦有学者研究认为，喉癌患者癌组织PINCH-1呈现出高表达，能够作为喉癌患者检测的蛋白标记物，为喉癌患者的靶向治疗提供新方向[21]。本研究显示，喉癌癌组织中PINCH-1表达较高。本文研究还发现，PINCH-1在中低分化、肿瘤浸润T3～T4期、TMN分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的喉癌患者癌组织中表达相对较高，说明PINCH-1表达与癌组织分化程度、肿瘤浸润深度、TMN分期、淋巴结转移情况等病理特征存在密切联系，在喉癌发生发展中具有重要作用。

综上所述，AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌组织中表达异常，且AQP1、miR-3195、PINCH-1表达变化与喉癌患者分化程度、肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况相关，三者表达存在一定的相关性，共同参与喉癌的发展过程。