西格列汀对2型糖尿病伴慢性心力衰竭病人心功能及外周血单个核细胞Sirt3/NF-κB通路的影响

王林青，孙云静，张亚静，薛洁乾，周 松

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)是慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)的独立危险因素，其中左室舒张功能障碍是T2DM的典型表现，也是影响CHF病人不良预后的独立危险因素[1]。临床研究显示，β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂等常规药物难以有效改善T2DM伴CHF病人的左室舒张功能，且降糖治疗无法改善T2DM病人的心血管疾病发生风险，强化血糖控制不能降低心力衰竭住院或死亡风险，因此改进治疗方案是临床关注的重点[2-3]。相关研究显示，二肽基肽酶4(DPP-4)抑制剂(西格列汀)通过增加活性肠促胰岛激素水平，以葡萄糖依赖方式增加胰岛素释放，降低胰高糖素水平，从而发挥良好的降糖效果[4]。西格列汀通过抑制机体炎性因子水平，从而发挥血管、心脏保护作用，降低心力衰竭和心血管死亡的风险[5]，关于西格列汀在T2DM伴CHF中的应用价值尚未明确。外周血单个核细胞沉默信息调节因子2相关酶3(silencing regulator 2 related enzyme 3，Sirt3)/核转录因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路参与调控机体的炎症反应，如NF-κB是炎症反应核心因子，在心肌细胞、血管内皮细胞中表达，引起心肌缺血损伤，且Sirt3/NF-κB通路在CHF发病机制中具有重要作用[6]。本研究观察西格列汀治疗T2DM伴CHF的疗效及其对外周血单个核细胞Sirt3/NF-κB通路的影响，从而为临床治疗方案的制定提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2020年2月我院收治的146例T2DM伴CHF病人，采用随机数字法分为观察组和对照组，每组73例。两组临床资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。病人入组前均签署知情同意书，且本研究已获得医院伦理委员会批准。

表1 两组临床资料比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 符合2017年《中国糖尿病防治栺南中华内分泌指南》[7]中的T2DM诊断标准；符合2018年《中国心力衰竭诊断和治疗指南》[8]中CHF的诊断标准；心功能分级Ⅰ～Ⅲ级。

1.2.2 排除标准 合并精神、血液、免疫系统疾病病人；1型糖尿病病人；CHF急性加重；合并肝、肾等脏器功能严重异常；患有肺源性心脏病、先天性心脏病、心脏瓣膜器质性病变、心房颤动、心律失常等严重心脏疾病；既往服用DPP-4抑制剂。

1.3 治疗方法 所有病人参照相关指南接受常规降糖[7-8]、抗心力衰竭治疗，如β-受体阻滞剂降低心率，利尿剂降低心脏负荷，抗血小板或抗凝药物治疗，他汀类调脂，纠正水盐电解质紊乱，口服降糖药物二甲双胍。治疗期间密切关注血糖、血压、心功能，并规范饮食、作息。观察组口服西格列汀(杭州默沙东制药有限公司生产，规格：每片100 mg，批准文号：国药准字J20140095)，每日100 mg。两组均治疗3个月。

1.4 疗效评定标准 治疗3个月后评估疗效[8]，显效：胸闷、气短、心悸、呼吸困难、运动受限等症状基本消失或完全消失，纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级改善超过2级，或恢复至正常状态；有效：胸闷、气短、心悸、呼吸困难等症状好转，NYHA分级改善1级；无效：临床症状及心功能分级均改善，甚至恶化。

1.5 观察指标

1.5.1 心功能指标 治疗前及治疗3个月后采用GE Vivid E9超声仪测定左室舒张末期内径(LVEDD)、舒张期室间隔厚度(IVST)及左室射血分数(LVEF)，测量3个心动周期，取平均值。

1.5.2 外周血单个核细胞内Sirt3/NF-κB通路相关mRNA 分别于治疗前及治疗3个月后采集病人外周静脉血3 mL，共3管，第1管室温离心10 min，重力加速度250×g，弃去上层血浆，下层细胞使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)平衡溶液稀释，于15 mL离心管中加入3 mL淋巴细胞分离液，加入细胞稀释液，室温离心10 min，重力加速度800×g，弃去上层液，吸取中间层液体，取5 mL PBS平衡溶液，再次离心15 min，重力加速度700×g，弃去上清液，剩余的颗粒状细胞为外周血单个核细胞。采用TRIzol试剂盒提取PBMCs内的总RNA，使用反转录试剂盒(赛默飞世尔)反转录RNA，使用聚合酶链式反应(PCR)试剂盒进行PCR扩增，引物序列见表2。扩增条件为90 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s，65 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，连续循环30次。以U6作为内参，根据Sirt3、NF-κB的mRNA与U6的Ct值计算相对表达量，以2-△△Ct表示，其中△△Ct=(Ct目的基因-CtU6)-(Ct对照目的基因-Ct对照U6)。

表2 引物序列

1.5.3 血糖水平监测 第2管外周静脉血采用全自动生化分析仪检测病人空腹血糖(FPG)、餐后1 h血糖(1 hPG)及餐后2 h血糖(2 hPG)。

1.5.4 炎症反应指标测定 第3管外周静脉血以3 000 r/ min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液保存于-80 ℃待测。采用酶联免疫吸附法测定血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，采用免疫比浊法测定血清C反应蛋白(CRP)水平。

1.5.5 主要不良心血管事件(MACE) 记录治疗期间MACE发生情况，包括再发心肌梗死、心力衰竭、心绞痛等。

2 结 果

2.1 两组临床疗效比较 观察组治疗总有效率(93.15%)高于对照组(82.19%)，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组临床疗效比较

2.2 两组心功能指标比较 治疗后，两组LVEDD、IVST下降，LVEF增加，且治疗后观察组心功能指标优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

2.3 两组外周血单个核细胞Sirt3/NF-κB通路相关mRNA水平比较 治疗后，两组外周血单个核细胞Sirt3 mRNA水平增加，NF-κB mRNA水平下降，其中观察组Sirt3 mRNA水平高于对照组，而NF-κB mRNA水平低于对照组(P<0.05)。详见表5。

2.4 两组血糖水平比较 治疗后，两组FPG、1 hPG、2 hPG水平均呈下降趋势，其中观察组血糖各指标水平低于对照组(P<0.05)。详见表6。

单位：mmol/L

2.5 两组血清炎性因子水平比较 治疗后，两组血清IL-6、TNF-α及CRP水平均下降，其中观察组血清炎性因子水平均低于对照组(P<0.05)。详见表7。

2.6 两组MACE发生情况比较 治疗期间，观察组和对照组MACE发生率比较，差异无统计学意义(5.48%和10.96%，P>0.05)。详见表8。

表8 两组MACE发生情况比较

3 讨 论

T2DM合并心力衰竭是临床的常见疾病，有研究显示，40%～50%的T2DM病人合并心力衰竭，且合并心力衰竭可进一步增加T2DM病人心血管死亡风险，因此，有效控制血糖对改善病人心功能具有重要的临床意义[1]。有研究显示，DPP-4抑制剂(西格列汀、沙格列汀、维格列汀等)具有良好的降糖效果，可发挥心血管保护作用(抗炎、降压、抗动脉粥样硬化、降脂、改善心功能等)，从而降低心血管事件风险及心力衰竭住院风险[9]。目前，病人接受西格列汀治疗后获益的潜在机制尚未明确。

本研究结果显示，观察组总有效率高于对照组，表明在常规药物治疗基础上使用西格列汀可显著改善T2DM伴CHF病人气短、心悸、胸闷、呼吸困难等临床病症及心功能分级，增加活动耐量，从而发挥良好的治疗作用。西格列汀通过抑制DPP-4防止胰高血糖素样肽-1及葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽的快速降解，从而增加内源性胰高血糖素样肽-1和抑胃肽水平，刺激胰岛素分泌，并降低胰高糖素水平，故治疗后血糖指标明显降低。谢云亮等[10]动物实验证实，西格列汀通过激活环状腺苷酸/蛋白激酶A/Rac相关C3肉毒素底物1(cAMP/PKA/Rac1)信号通路，抑制脾脏CD4+T细胞的迁徙能力，可减轻炎症反应及非肥胖型糖尿病小鼠胰岛炎症浸润情况，增加胰岛存活和体内胰岛素水平，发挥良好的降糖效果。西格列汀通过增加胰高血糖素样肽-1水平，改善血管内皮功能，抑制心肌细胞凋亡，减少心肌细胞坏死，从而发挥心脏保护作用。

本研究结果显示，治疗后，观察组心功能指标(IVST、LVEDD、LVEF)改善程度优于对照组，进一步证实西格列汀的心脏保护作用。西格列汀通过抑制Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路，降低炎性因子(单核细胞趋化蛋白-1、NF-κB)水平，增加基质细胞源性因子-1α水平，减少内皮细胞损伤，促进内皮修复，从而保护血管，改善心功能[10-11]。本研究治疗后，观察组炎性因子水平降低，心功能指标水平改善。 多项研究显示，Sirt3/NF-κB通路具有调控机体炎症反应，心肌缺血损伤等作用，Sirt3可促使线粒体中乙酰化蛋白去乙酰化，进而参与细胞能量代谢、活性氧清除的过程，调控细胞增殖、分化，而NF-κB为炎症反应核心因子，参与机体免疫、炎症反应、损伤修复及细胞凋亡等生理活动，加重心肌细胞损伤和疾病进展[12-13]。王韦等[14]研究发现，辛伐他汀可调控外周血单个核细胞内Sirt3/NF-κB通路，减轻CHF病人炎症反应，改善心功能分级，降低不良心脏事件风险，提高临床疗效。本研究结果显示，观察组外周血单个核细胞Sirt3 mRNA水平增加，NF-κB mRNA水平下降(P<0.05)，表明西格列汀通过调控外周血单个核细胞Sirt3/NF-κB通路，降低炎症反应，改善病人心功能。Sirt3可激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，进而降低血管内皮生长因子、低氧诱导因子-2表达，抑制血管新生，通过抑制心肌组织NF-κB，减轻炎症反应和心肌组织纤维化，发挥心脏保护功能[15]，结合本研究结果认为，西格列汀可能通过上调Sirt3表达抑制NF-κB表达，进而降低炎性因子(IL-6、TNF-α及CRP)表达，减轻心肌细胞炎症反应，避免心脏结构功能改变，发挥治疗效果。有研究认为，Sirt3作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶之一，调控线粒体内蛋白去乙酰化，抑制氧自由基形成，发挥抗氧化作用，延缓细胞凋亡、衰老[16]。杨荣培等[17]研究显示，使用槲皮素可调控Sirt1/NF-κB信号通路，从而减轻大鼠左心室肥厚程度及心肌纤维化，使用特异性抑制剂调控Sirt1/NF-κB，再次上调NF-κB表达，阻断槲皮素的心脏保护作用。结合本研究结果推断西格列汀可能参与调控Sirt3/NF-κB通路进而发挥心脏保护作用。

综上所述，西格列汀治疗T2DM伴CHF疗效显著，可有效调控血糖水平，降低炎症反应，改善心功能，其作用机制可能与调控外周血单个核细胞内Sirt3/NF-κB通路有关。