水稻种子内生细菌研究进展

王志山 黎妮 王伟平 刘洋

（1. 北京科技大学化学与生物工程学院，北京100083；2. 湖南杂交水稻研究中心杂交水稻国家重点实验室，长沙410125）

植物内生菌（endophyte）是一类一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部而不引起侵染症状的重要微生物资源，在长期的相互作用过程中，植物与内生菌已经形成了互惠互利的关系，成为植物进化过程的重要组成部分［1-3］。植物内生菌的发现最早可以追溯到100多年前，但是由于其本身特性，即寄主植物未表现出类似于病原菌感染的症状，所以一直被人们忽视；直到20世纪30年代，许多牲畜由于食用感染内生真菌的牧草导致中毒，给畜牧业造成重大损失，为此植物内生菌的研究也才真正引起人们的重视。已有研究表明，植物中存在大量内生菌，它们在宿主植物的内部组织中定居并形成一系列互利、共生、共栖的关系［4］。植物内生菌除了具有促进幼苗萌发、促进植物生长、提高产量、增强抗性、诱导次生代谢产物合成等生物功能外，其天然产物在医药业、农业、工业等领域都具有潜在用途［5-8］。

种子既是植物的繁殖器官、植物遗传信息的保存者和传递者，也是植物在逆境胁迫中保证物种繁衍的适应性策略，对植物繁殖后代及农业生产具有重要意义［9-10］。大量研究证明，植物种子中含有丰富的内生菌资源，在植物繁衍过程中，种子是细菌从母本植株到子代个体的传播介质，负责将有益细菌代代相传，从而对植物的生长发育及品质产量等生物性状产生直接或间接的影响［3，11-13］。水稻作为禾本科作物，是植物与内生菌相互作用的理想模式植物，研究水稻种子与其内生菌之间的作用关系及机理，对水稻增产、病虫害防治有积极意义。本文结合近年来本项目组的研究进展及相关领域动态，从水稻种子内生菌多样性、种子与内生菌分布的相关性、内生菌生物学功能以及垂直传递规律等4个方面，系统总结近年来水稻种子内生菌研究领域所取得的进展，旨在为后续水稻种子内生菌的相关研究提供思路和方向。

1 水稻种子内生菌多样性研究

随着分子生物学技术发展和检测手段的不断提高，水稻内生菌检测的灵敏度越来越高，水稻内生菌的多样性研究已成为水稻内生菌研究领域的重要内容。水稻内生菌除了包括与水稻构成互惠共利关系的内生真菌、细菌和放线菌外，还包括潜伏在水稻体内的病原微生物。研究水稻内生菌的多样性对于探究水稻体内的细菌群结构组成及其变化规律等有重要意义，同时也能为相关功能菌株的筛选和应用提供理论依据。

1.1 利用分离培养方法（isolation and culture methods）揭示水稻种子内生细菌多样性

分离培养技术是一种传统的植物内生菌多样性研究技术，其常被研究人员用来探究水稻种子内生细菌的多样性。例如，李南南等［14］采用传统微生物培养方法对3个品种的杂交水稻种子内生细菌群落结构多样性进行了分析，结果表明这些杂交水稻种子内生细菌群落结构具有多样性，其中在门水平主 要 以 Firmicutes、Proteobacteria和 Actinobacteria类群为主，但在属水平上三者存在优势属及丰度差异。另有报道采用分离培养技术探究寄主基因型和盐胁迫对盐敏感和耐盐水稻品种种子内生细菌群落的影响，试验结果表明水稻种子内部的内生细菌群落具有相当丰富的多样性，而且在盐胁迫条件下，盐敏感和耐盐水稻品种的内生细菌群落向黄杆菌属（Flavobacterium）、泛菌属（Pantoea）、肠杆菌属（Enterobacter）、微杆菌属（Microbacterium）、小坂菌属（Kosakonia）和短小杆菌属（Curtobacterium）的细菌类群转移［15］。此外，也有报道采用分离培养技术揭示出水稻种子中存在种类繁多的内生细菌［16-20］。

1.2 利用非培养方法（culture-independent methods）揭示水稻种子内生细菌多样性

传统的分离培养技术具有一定的局限性，只能鉴定出寄主植物内一些可培养的内生菌，且分离出的大多数是较活跃的少量内生菌类群。对于植物体内无法培养的内生菌，则需要采用非培养技术加以鉴定，而且有必要使用多相方法对可培养和不可培养的两类内生菌进行全面的分析研究。目前，用于植物内生菌多样性分析的非培养技术主要包括16S rDNA克隆文库技术、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术和高通量测序技术（high-throughput sequencing）等［3，21-25］。

16S rDNA克隆文库技术与DGGE技术出现的比较早，有研究人员利用这两种技术探究了水稻种子内生细菌的多样性［21，26］。但是随着测序技术的发展，近年来越来越多的研究人员开始使用高通量测序方法探究水稻种子内生细菌的多样性。Zhang等［25］采用基于Illumina的16S rRNA基因对水稻种子内生细菌群落进行研究时发现，水稻种子内存在种类丰富的内生细菌，而且首次在水稻种子中检测到一些细菌菌群，如酸杆菌门（Acidobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、衣原体（Chlamydiae）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。本课题组之前也利用同样方法探究了超级杂交稻与旱稻种子的内生细菌多样性发现，不同品种种子间也存在类型丰富的内生细菌，且很多细菌类型与之前的报道结果一致［3，27］。由此可见，在未来的水稻内生菌的研究中，通过结合传统的分离培养方法和非培养分析方法，可以为研究水稻内生菌提供强有力的技术支撑，有助于鉴定并获得一些新的难以分离筛选的功能性内生菌株。

2 水稻种子与其内生细菌分布的相关性研究

2.1 种子内部结构与内生细菌的相关性

已有报道指出，植物种子内部的不同结构中内生细菌分布有差异［28-31］。对于水稻种子而言，Eyre等［32］利用高通量测序技术鉴定水稻种子微生物群落，结果同样证实水稻种子由内到外不同结构部位内生细菌分布不同。总体而言，水稻种子内生细菌的扩增子序列变异体（amplicon sequencing variants，ASV）由外至内呈下降趋势，但种子内部的细菌多样性比外壳和种皮的细菌多样性高，表明水稻种子内部虽然存在的细菌类群数量不多，但其丰度相比于种子外部更均匀。此外，研究人员还发现水稻种子外壳及种皮等隔室中α-变形菌（α-Proteobacteria）的丰度远高于种子内部，而种子内部γ-变形菌（γ-Proteobacteria）的丰度高于种子外壳及种皮部分［32］。由此可见，水稻种子内生细菌类群分布与其内部结构密切相关。

2.2 种子发育时期与内生细菌的相关性

种子从形成、成熟到最终发芽，不同发育时期内生细菌类群是呈动态变化的，其种类和组成会发生改变，某些种类细菌也会发生运动和转移，尤其是随着种子的发育，淀粉等营养物质的积累和变化会影响到其固有微生物种类的组成［33］。对于杂交水稻亲本深08S、620S和16A007种子灌浆期及成熟期两个不同发育时期内生细菌多样性的研究表明，3个品种水稻种子不同发育时期的内生细菌群落结构变化明显，种子成熟期内生细菌种类较灌浆期更高，而且优势细菌种类也存在差异［34］。另有研究指出，当种子吸胀后，其初级和次级代谢物会迅速释放到邻近的土壤，从而形成一个“萌发种子周围微生物活性升高”的区域，即种子际（spermosphere），由于种子际高度集中微生物生长所需营养物质，所以种子上或种子内的细菌相比于周围土壤环境中的微生物类群具有更大的竞争优势，表明种子际相关微生物类群组成可能受土壤环境影响更大［35］，同时种子吸胀萌发时间对于种子际微生物菌落在门、属水平上的类型和丰度都有一定影响［36］。从研究文献检索情况来看，目前对于水稻种子发育时期与其内生细菌演替的研究仍然有限。

2.3 种子化学成分与内生细菌的相关性

水稻种子内部常见的化学成分大多是一些营养物质，如淀粉、储藏蛋白和脂类等，它们以不同的比例储藏在种子各组织中［37］。这些营养物质不仅是水稻种子发育生长所需，同时也是种子内生细菌赖以生存的物质条件，故水稻种子的化学成分与其内生细菌可能存在一定相关性。根据已有报道，随着水稻种子的成熟，内部淀粉等营养物质含量会逐渐上升，水分含量也会相应发生变化，这一系列化学组分的变化会直接或间接地影响种子内生菌的群落结构组成，具有产生分解淀粉等营养物质的相关酶、耐高渗透压及抗菌活性的内生菌会明显增多［38-40］。另一方面，有研究人员对分离自水稻种子内部的有益内生细菌进行功能探究，结果发现这些内生菌对于植物的生长、生化组分及营养物质积累也有很强的促进作用［19，41-42］。然而，根据以上研究报道也只能初步判断水稻种子化学成分与其内生细菌之间具有潜在的相关性，至于种子化学成分分布对于其内生细菌分布是否直接产生影响还需要研究人员进行更深层次的探究。

2.4 种子活力与内生细菌的相关性

种子活力是衡量种子质量的重要指标之一，决定着植物能否迅速、均匀地出苗并且能够发育为正常植株。一般活力较高的种子其杂交的后代往往具备较高活力，而植物种子如果保存条件良好，其活力也可以保持几年甚至几十年，所以说，植物种子活力的影响因素一般包括遗传因素与环境因素两方面［33，43-44］。最新研究发现，植物种子的活力高低对其内生菌群落多样和密度也有很大的影响。研究人员观察到，潮湿气候下植物种子由于具有较干燥环境下更适宜的生长条件，其活力往往更高，所以长出植株的均匀度好、抗病能力也就更强，而针对其内生菌进行研究发现，高湿环境下生长的植物种子其内生细菌的群落更密集，多样性也更高［45］。除此之外，如果从遗传学角度去考虑，虽然大多研究都表明种子活力与其基因型有直接联系，但种子母本植株垂直传播的相关内生细菌对于种子活力也是一个重要影响因素［46-48］。目前，水稻种子活力高低与其内生细菌的相关性研究还比较少。之前有研究人员将分离自杂交水稻种子的细菌接种到6份杂交稻样品中，以验证其是否对水稻种子结实率及生活力产生影响，结果表明喷施该细菌对延长水稻种子活力有明显效果，其中喷施细菌液后当代水稻种子带细菌率相比对照组增加5.4%-37.8%，储藏两年后带细菌率相比对照组增加0.7%-9.7%，发芽率增加16.1%-26.1%［49］。

2.5 种子基因型与内生细菌的相关性

水稻种子作为携带亲本基因的雏形植物体（microphyte），具有一致性和遗传性特征，因此，水稻的基因型与种子的内生细菌之间可能具有某种相关性，越来越多的研究报道也证实了这一观点。研究人员在分析水稻种子内生细菌群落结构及多样性时发现，水稻种子基因型对种子内生细菌群落多样性、结构、分布、丰度有一定影响［3，11，15，20，25］，不同基因型的种子之间虽然存在共存的内生优势细菌类群，但它们在内生细菌群落结构与多样性方面存在差异［3，50］。有些研究发现不同品种种子间的内生细菌群落结构与多样性较相似，但在细菌类群的丰度上其间仍存在一定差异［27］。值得一提的是，部分研究表明，水稻亲本与其杂交子代的种子内生细菌群落结构与多样性也具有明显的相关性，而且它们的内生优势细菌尤为相似［3，11］。总而言之，上述研究为水稻种子基因型与内生细菌的分布具有相关性提供了有力的论据。

2.6 水稻抗病性与种子内生细菌的相关性

稻瘟病、纹枯病、恶苗病等都是水稻生长发育过程中最常见的病害，这些病害的大面积发生会严重影响水稻产量［51］。最新研究发现，水稻种子内生细菌作为宿主植物的“延伸免疫系统”，对于水稻拮抗病原菌有着重大作用。研究指出，水稻抗病性分化不仅具有地理分布差异性，而且与其种子内生细菌群落结构的差异紧密相关，其中具有抗性表型的水稻种子鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的富集显著，并且其核心成员——瓜类鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas melonis）除能在具有抗性表型的种子中世代传递外，亦可赋予易感表型抗病性［52］。在进行深入的机制探究后发现，瓜类鞘氨醇单胞菌在水稻感染细菌性穗枯病菌（Burkholderia plantarii）时会作出负反馈响应并在在质外体中积累化学小分子信号氨茴酸，当B. plantarii接触氨茴酸后，其RpoS转录级联反应调控的毒力因子（tropolone）生物合成通路就会受到干扰，导致侵染力的丧失［52］。除此之外，也有部分研究从水稻种子中分离出具有拮抗水稻相应病原菌活性的内生细菌菌株［7，53-55］，而且进一步实验表明，具拮抗活性的细菌菌液处理的水稻种子病害发生率会大幅度降低，萌发幼苗的茎长与根长比对照长［7］。综上所述，水稻本身的抗病性高低对于其种子中的内生细菌会有一定的筛选作用，且水稻种子中这些抗病性较强的内生细菌对于水稻的生长和抗病虫害能力都有一定的促进与增强作用，说明研究人员能在一些抗病性较强的水稻种子中筛选并鉴定出一些具有抗病性的内生细菌并不是偶然的。

3 水稻种子内生细菌的生物学功能研究

3.1 直接促生长作用

种子内生细菌一般通过分泌和诱导产生植物生长调节物质、溶解土壤中的磷元素及合成并分泌铁载体等机理，对植物生长发育产生直接影响［41，56-62］。研究发现，水稻种子内生细菌对水稻的直接促生长作用也是通过类似的机制实现。Shahzad等［56］对水稻种子所携带的内生细菌进行分离鉴定并评估了它们在植物激素生产和促进生长方面的潜力，实验结果表明，水稻种子中产生吲哚-3-乙酸（IAA）的内生细菌显著提高了植株的大部分生长特性（茎和根长、鲜生物量和干生物量及叶绿素含量等）。此外，研究人员通过对水稻种子内生细菌的促生特性研究发现，水稻中通过种子传播的内生细菌可以通过调节植物激素及某些代谢产物、固氮、分泌铁载体和溶解磷酸盐等多重作用促进水稻植株的生长［41，63］。

3.2 间接促生长作用

种子内生细菌除了可以通过合成并分泌植物生长激素、铁载体等来直接对植物生长产生促进作用外，种子内生细菌也可以通过提高植物对环境胁迫的抗性、产生生物固氮作用或提高对植物病原微生物的拮抗作用等来间接促进植物生长［57-58，64-69］。研究表明，包括水稻在内的大部分植物内生固氮菌一般通过定殖在植物内部并利用植物本身碳源，与植物进行联合固氮，促进植物生长，同时植物体内相对低氧的状态也有利于细菌固氮酶的表达与作用［70-71］。研究人员也已经在水稻种子中分离出具有固氮作用的内生细菌［41，63］。与此同时，水稻种子中具有拮抗病原微生物的内生细菌也是水稻内生菌研究领域的一大热点。截至目前，研究人员已经从水稻种子中分离得到了一批具有良好抑病效果的植物内生细菌［7，52-55］。水稻种子内生细菌拮抗病原微生物的机制主要包括分泌抗生素等抗菌物质、竞争生态位与营养物质、诱导系统抗性、作为外源基因载体等几方面［52，72-73］。本课题组利用高通量测序技术对水稻种子内生细菌进行分析时发现旱稻种子中除含有水稻种子中常见的一些内生细菌外，也有抗旱性较强的细菌属［27］；对于耐盐碱水稻种子内生细菌进行研究时同样分离鉴定出多株具有耐盐活性的细菌（数据尚未发表）。由此可见，水稻种子内生细菌对于宿主的抗逆性增强也可能发挥着重要作用，但是目前这方面的研究还相对较少，相关的机制研究也有待进一步探究。

4 水稻种子内生细菌的垂直传递研究

植物体可以通过世代间及其个体生命周期中获得其内生微生物群落的能力来应对其生存环境的改变［74］。植物中的微生物能够通过水平转移和垂直传递的方式从环境和母体植物中获得，而在通过垂直传播所形成的植物体中，这种关系是专性的，这些微生物整个生命周期全部在宿主植物体内度过，往往无法在环境中独立生存［75］，并且当这种互惠互利的关系稳定建立之后，就会在该植物的世代之间进化出内生微生物的垂直传播途径，以确保这种有益的互利关系从一代忠实地传递到下一代，并在种子萌发及植物成长过程中发挥重要生物学作用［67，76］。种子是内生菌在宿主植物世代之间垂直传递的主要途径，并充当植物微生物组的储存库［35，77-80］。支持植物内生菌通过种子垂直传递的现有证据来自证实种子与幼苗之间内生菌类群重叠关系的研究［74，81］，且研究发现与种子外部菌群相比，种子内的微生物更具有迅速定殖于新生植物并占据植物体内空间的优势，且更易于利用植物所提供的营养成分［82］。截至目前，已有研究报道表明多种植物存在可以在宿主植物世代之间连续垂直传递的特定菌群［3，29，74，83-87］。目前，水稻种子内生细菌的垂直传递研究也已经取得了一定成果。Walitang等［11］研究了水稻种子经过杂交、重复近交、人类选择和在不同生态地理位置种植后其内生菌组成随时间的变化，结果发现双亲或双亲之一在后代种子内生菌的形成过程中做出了重大贡献，后代的大多数末端限制性片段（T-RFs）可以追溯到其任何一个亲本或双亲，即使在不同的地理位置重新种植，许多类似的内生细菌群体仍然存在于种子中。本课题组以我国自主培育的超级杂交稻新品种深两优5814及其亲本Y58S和C4114种子作为材料，研究了它们的内生细菌结构和多样性，实验结果表明3个样品虽然在内生细菌群落组成和结构上存在明显差异，但子代种子的优势内生细菌属与其亲本保持一致，均为Pantoea［3］。由此可见，水稻亲本对于其后代种子内生菌的形成过程有重要作用，而且种子中存在特定菌群在水稻世代之间存在垂直传递的连续性，母源传播很可能是水稻种子微生物群落传播的主要途径［3，11，88］。

5 杂交水稻（hybrid rice）种子内生细菌研究现状及展望

5.1 杂交水稻种子内生细菌研究现状

杂交水稻一般是指两个在遗传上有一定差异但其优良性状能互补的水稻亲本进行杂交所产生的具有杂种优势的水稻品种，其普遍具有高产、优质、广适及多抗等特点［89］。针对杂交水稻种子内生细菌的多样性与群落结构进行的相关研究结果表明，杂交水稻种子中不仅存在种类丰富的内生细菌属，而且其中的优势属与常规水稻品种种子中的优势细菌 属 类 似，Pantoea、Bacillus、Methylobacterium、Pseudomonas、Sphingomonas及Rhizobium 等 细菌同样存在于杂交水稻种子中［3，14，16-17，90-92］。Liu 等［93］也从杂交水稻种子中分离到一株新的细菌，并将其命名为湖南拟芽孢杆菌（Paenibacillus hunanensis sp. nov.）。深两优5814是一个在生产上大面积应用的杂交水稻品种，有研究人员通过拮抗实验从其种子中分离到一株内生细菌菌株Paenibacillus polymyxa RSE1，研究结果表明这株菌对于稻曲病菌（Ustilaginoidea oryzae）CICC具有较强的拮抗活性［54］。本课题组通过平板对峙实验也从杂交水稻深两优5814种子中分离出一株对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）ACCC 36020有明显拮抗活性的菌株 JK，经鉴定这株菌为 Bacillus velezensis［55］。总体而言，目前对于杂交水稻种子内生细菌的研究相对较少，尤其是不同类型的杂交水稻种子与其内生细菌的相关性研究鲜有报道。

5.2 杂交水稻种子内生细菌未来研究方向

对杂交水稻种子内生细菌开展系统研究，对于从微生态学角度揭示杂交水稻高产、优质、多抗机制具有重要作用。开展不同类型杂交水稻品种种子内生细菌的遗传多样性、亲本与子一代的垂直传递规律、种子内生细菌对杂交水稻产量、品质、抗性（抗病虫、耐逆等）的形成机制等研究，解决杂交稻种子益生菌定殖关键技术，利用现代生物技术研发人工益生细菌，研发一批有益促生菌剂应用于杂交水稻生产，促进杂交水稻高产、优质、多抗，推动杂交水稻高产高效绿色生产发展，为保障国家粮食安全提供科技支撑，这是杂交水稻种子内生细菌未来的重点研究方向。

6 结语

对于植物内生菌与育种的关系，一种新的育种策略“植物与微生物共生体育种（plant holobiont breeding）”思路也被提出［94］。该育种思路的立论基于两点：一是某些植物的培育实际上是植物/微生物共生体的培育；二是植物内生菌与宿主植物之间或多或少存在相互作用，不同基因型的宿主植物对内生菌的种类和分布等均可能有所选择。因此，可以设想通过改变宿主植物的遗传背景，改变宿主植物从环境中接纳的植物内生菌种类，从而达到改变植物（实际上是植物内生菌/宿主共同体）表型的目的。基于这种育种设想，今后在水稻育种中可能也需要考虑微生物因素，重视微生物在水稻新品种表型及其他性状形成中的影响，加强微生物对水稻育种事业的贡献值，这不仅对丰富作物育种科学内涵，还是对生产应用而言，都是一件有意义的工作。因此，杂交水稻种子内生细菌的研究今后主要还是围绕杂交水稻高产、优质、多抗等特性开展，重点开展杂交水稻种子内生促生菌与内生拮抗菌资源鉴定筛选，并通过杂交水稻与微生物相互作用的研究阐明其机制机理，达到从植物中来到植物中去的内生菌挖掘与利用目标，最终实现共生体育种目标。同时，结合水稻种子内生菌垂直传递、子代对于亲本优势细菌继承等研究，为水稻杂种优势利用提供微生物生态学佐证，也值得深入研究和探索。