基于网络药理学及实验验证探究草果挥发油改善急性胃炎的作用机制

金宝宇，杨 斌，王存萍，张博宇，顾 健

(西南民族大学药学院，四川 成都 610041)

急性胃炎是常见的消化系统疾病，是因应激、药物、感染等因素引起的胃黏膜损伤，临床症状表现为上腹痛、腹胀、恶心、呕吐、食欲不振、黑便、休克等[1]，属于中医学“胃脘痛”“呕吐”等范畴[2].当胃黏膜攻击因子、防御因子失衡，便会引起胃黏膜氧化应激损伤、炎症等[3].目前，急性胃炎主要采用常规西药治疗，但存在一定副作用[4].而中草药因其“多靶点、毒副作用小、成本低”等特点，越来越受到人们的关注.

草果(Amomum tsao-koCrevost et Lemaire)是姜科豆蔻属植物的干燥果实.归脾、胃经，有燥湿温中，截疟除痰的功效，用于寒湿内阻，脘腹胀痛，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热[5].研究表明，草果有抗炎镇痛、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等药理作用[6].从中提取的挥发油经药理实验验证具有促进胃泌素分泌[7]、促进胃排空、抗炎、抑菌、防霉、抗辐射诱变等作用[8]，足够的胃黏膜血流、一定水平胃泌素能够提供胃黏膜营养物质，提高胃黏膜防御水平.也有研究表明，草果提取物能有效改善由幽门螺旋杆菌引起的小鼠胃溃疡形成[9].说明草果挥发油可能对急性胃炎有治疗作用，因此借助网络药理学等方法开展研究.

网络药理学已广泛应用于系统性、整体性地预测中药药效物质基础及其分子机制[10].因此，本研究通过药效学实验说明草果挥发油治疗急性胃炎的有效性，并采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)鉴定草果挥发油成分，借助网络药理学、分子生物学实验探究草果挥发油抗急性胃炎的作用机制.

1 材料

1.1 动物

SPF 级ICR 小鼠60 只，22～25 g，购自成都达硕实验动物研究中心，动物许可证SCXK(川)2020-030.动物于温度(23 ±1)℃，相对湿度55% ±5%，明暗循环为12 h 的环境中饲养和自由饮水.

1.2 药品与试剂

草果购自四川省洪雅县，经西南民族大学药学院顾健教授鉴定为姜科豆蔻属植物草果的干燥成熟果实；无水硫酸钠(天津福晨化学试剂有限公司，批号20200612)；吐温80(福晨(天津)化学试剂有限公司，生产批号:20190820)；浓盐酸(四川西陇科学有限公司)；乙醇(成都市科隆化学品有限公司，生产批号2021110402)；雷尼替丁(苏州弘森药业有限公司，生产批号306210324)；冰醋酸(天津市致远化学试剂有限公司，生产批号:202006145)；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α，货号F2132-A)购自上海泛柯实业有限公司.

1.3 仪器

QP2010 Ultra GC-MS 仪(日本Shimadzu 公司)；DZTW 型电子调温电热套(浙江力凡仪器科技有限公司)；JA2003 电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号JBP5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016)；冻台(武汉俊杰电子有限公司，型号JBL5)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-P)；烤箱(天津市莱玻瑞仪器设备有限公司，型号GFL-230)；载玻片及盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司，型号1027105P-G)；正置光学显微镜(日本尼康，型号NIKON ECLIPSE E100)；成像系统(日本尼康，型号NIKON DS-U3)；Cytation5 型多功能酶标仪(美国Bio-Tek 公司，型号CYT5M)；电泳仪(Bio-Rad Laboratorie，型号PowerPac Basic)；垂直电泳槽及组件(Bio-Rad Laboratorie，型号Mini-PROTEAN)；转印槽及组件(Bio-Rad Laboratorie，型号Mini-Trans-Blot Cell)；生物样品低温快速制备离心系统(杭州遂真生物技术有限公司，型号BSH-CL2)；恒温金属浴(美国赛洛捷克 SCILOGEX，型号 SCI-100HCM-Pro)；化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司，型号ChemiScope 6100).

2 方法

2.1 草果挥发油的制备

采用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油，经无水硫酸钠干燥，得黄色澄明挥发油.

2.2 草果挥发油的GC-MS 分析

2.2.1 色谱条件

色谱柱:DB-1，30 m ×0.25 mm ×0.25 um；进样口温度:300 ℃；分流比:120:1；进样量:1 μL；载气:氦气(99.999%)；初始温度:40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至140 ℃，以20 ℃/min，升至290 ℃，10 min.

2.2.2 质谱条件

扫描方式:SCAN 扫描；离子源:EI 源；传输线:300 ℃；电离能量:70 V；离子源温度:230 ℃；四极杆温度:150 ℃；扫描范围:29～550 m/z；溶剂延迟:1.2 min.

2.3 网络药理学分析

2.3.1 成分、疾病靶点获取及网络构建

将GC-MS 获取的成分信息输入PubChem 等数据库检索获得SMILES 结构，上传至Swiss Target Prediction 数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取草果挥发油成分靶点[11]；以“gastritis”为关键词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库获取胃炎靶点；将成分、疾病靶点取交集，得草果挥发油作用急性胃炎靶点，利用Cytoscape 3.7.1 构建“成分—靶点—疾病”网络.

2.3.2 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及关键靶点的筛选

将成分、疾病交集靶点导入STRING(https://www.String-db.org/)数据库获取PPI 结果[11]，利用Cytoscape 3.7.1 进行网络拓扑分析，筛选出度值(degree)大于平均值的靶点即为关键靶点.

2.3.3 GO 功能分析与KEGG 通路富集分析

关键靶点通过Metascape 平台进行GO 功能分析及KEGG 通路富集分析，利用微生信(www.bioinformatics.com.cn)网站进行可视化.

2.4 药效学实验

2.4.1 造模及方法

60 只小鼠分为正常组、模型组、雷尼替丁组40 mg/Kg、草果挥发油低、中、高剂量组(12、24、48 mg/Kg).正常组与模型组均灌胃给予生理盐水，其余各组小鼠分别灌胃给予相应药物，连续给药5 d，2 次/d，末次给药前24 h，禁食不禁水.末次给药60 min后，除正常组外均灌胃给予60%乙醇与40%150 mM HCL 混合溶液0.3 mL，正常组以生理盐水代替造模剂平行操作.1 h 后，眼球取血、取胃组织进行后续实验[12].

2.4.2 胃组织病理学观察

将胃组织固定在4%甲醛溶液中48 h，用75%、85%、95%的梯度乙醇对胃组织进行处理，再放入无水乙醇中进行脱水、石蜡包埋、切片后用HE 染色，在显微镜下观察.

2.4.3 TNF-α 检测

取小鼠血清，ELISA 试剂盒检测TNF-α 含量.

2.5 免疫印迹试验(Western blot，WB)检测胃组织中TNF-α、EGFR 蛋白表达量

胃组织于冰上匀浆离心后取上清液，BCA 法测定蛋白浓度.蛋白样品加入5 ×蛋白上样缓冲液，70 ℃加热5～10 min，制备浓缩胶和分离胶，以GAPDH 为内参，进行电泳将样本中蛋白进行分离，将蛋白转移至PVDF 膜上.以GAPDH 为内参，进行电泳将样本中蛋白进行分离，300 mA 恒流转膜0.5 h，25 V 恒压转膜过夜.5%的脱脂牛奶进行封闭，室温孵育一抗3 h，室温孵育二抗1 h，使用发光试剂进行显色，化学发光成像系统下采集图像并对条带进行灰度分析.

2.6 统计分析

使用统计软件GraphPad Prism 9.0 分析结果，数据以表示，组间比较采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)，P＜0.05 认为差异有统计学意义.

3 结果

3.1 草果挥发油化学成分鉴定

通过气相色谱-质谱数据库NIST08.LIB 数据匹配，结合文献资料解析，鉴定出草果挥发油化学成分38 个，总离子流图如图1.其中烯烃类成分8 个、醇类成分9 个、醛类成分9 个、酯类成分3 个、苯及其衍生物2 个、其他类型成分7 个.如表1 所示，桉叶油醇占比最高，为14.11%.

图1 草果挥发油GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of GC-MS of volatile oil of Amomum tsao-ko

表1 草果挥发油成分定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile oil of Amomum tsao-ko

续表1

3.2 成分、疾病靶点获取及网络构建分析

通过Swiss Target Prediction 数据库获得成分靶点756 个，通过GeneCards 数据库获取疾病靶点1 202个，二者取交集的共有靶点84 个；“成分-靶点-疾病”网络如图2，网络共有110 个节点、287 条边，平均度值5.22.图中左侧紫红色节点代表草果挥发油，六边形节点代表挥发油成分，中间椭圆节点代表挥发油成分作用急性胃炎靶点，右侧绿色节点代表胃炎疾病，代表成分与靶点的节点面积越大、颜色越深(蓝→橙)代表度值越高.草果挥发油成分共24 个，其中CG30、CG21、CG16、CG34、CG37、CG35、CG7 的度值均≧11，度值≧6 的成分占总成份46%.CG1、CG3、CG6 等14个成分无作用胃炎靶点，予以剔除；交集靶点中PTGS2、CHRM3、ADH1B、AR、CA2、PTGS1、PGR、ADH7 度值≧6，度值≧3 的靶点占总靶点44%.

图2 草果挥发油治疗胃炎的“成分—靶点—疾病”网络Fig.2 “Ingredient-target-disease” network of volatile oil of Amomum tsao-ko to treat gastritis

3.3 PPI 网络构建分析

将PPI 网络数据导入Cytoscape 3.7.1 软件，如图3 所示.节点代表靶点，节点面积越大、颜色越深(蓝→橙)代表度值越高(图4 同).网络共有84 个节点，616 条边，平均度值为14，度值≧3 的靶点占总靶点95.23%，度值≧30 的靶点主要有TNF、EGFR、原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC(Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src)、丝裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)等.筛选出大于平均度值的靶点38 个如图4，其中TNF 度值最高，其次为EGFR，提示这些靶点可能在草果挥发油治疗胃炎中发挥重要作用.

图3 草果挥发油治疗胃炎靶点的PPI 网络Fig.3 PPI network of volatile oil of Amomum tsao-ko to treat gastritis

图4 草果挥发油治疗胃炎核心靶点的相互作用关系Fig.4 Key targets interaction of volatile oil of Amomum tsao-ko to treat gastritis

3.4 GO 功能分析及KEGG 通路富集分析

3.4.1 GO 功能分析

将核心靶点输入Metascape 数据库进行生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)富集注释，将显著性强的前十个组分导入微生信网站进行可视化[13]，如图5.BP 结果显示，草果挥发油治疗胃炎主要涉及细胞定位的调控、蛋白质磷酸化的正调控、细胞对化学应激的反应等；CC 结果显示，草果挥发油治疗胃炎主要涉及膜筏、膜微域、小胞等；MF 结果显示，草果挥发油治疗胃炎主要涉及蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶结合等.

图5 草果挥发油治疗胃炎潜在靶点GO 分析(前10)Fig.5 GO analysis of potential targets of oil of Amomum tsao-ko for gastritis (top 10)

3.4.2 KEGG 通路富集分析

利用Metascape 平台进行KEGG 通路富集分析共得到140 条通路，选取P 值较小、与胃部疾病相关的前20 个进行可视化分析，结果涉及癌症通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路等，如图6.提示草果挥发油成分可能通过这些通路进行调控从而发挥抗急性胃炎的作用.

图6 草果挥发油治疗胃炎潜在靶点KEGG 分析(前20)Fig.6 KEGG analysis of potential targets of oil of Amomum tsao-ko for gastritis (top 20)

3.5 药效学实验

3.5.1 胃组织病理学观察

通过HE 染色观察到正常组小鼠胃黏膜组织各层结构完整清晰，细胞形态完整，腺体排列规则，未见组织缺损、出血、炎症等异常病变[14].模型组黏膜深层坏死、水肿，炎性细胞浸润.相对于模型组，草果挥发油各剂量组胃损伤程度均有改善，发生较轻的胃黏膜上层结构破坏、水肿等.雷尼替丁组胃黏膜组织修复，无损伤情况，见图7.与正常组相比，模型组胃组织病理学评分显著升高(P＜0.001).与模型组相比，草果挥发油中、高剂量组评分显著下降(P＜0.01)，具有统计学意义.病理学评分越高，代表小鼠胃黏膜损伤程度越重，如图8.结果表明，草果挥发油对改善急性胃炎作用明显.

图7 胃组织HE 染色(100 ×)Fig.7 HE staining of gastrictissue(100 ×)

图8 草果挥发油对模型小鼠胃黏膜损伤程度的影响( x- ±s，n ＝3)Fig.8 Effect of volatile oil from Amomum tsao-ko on the extent of gastric mucosa damage in model mice( x- ±s，n ＝3)

3.5.2 草果挥发油对急性胃炎小鼠血清TNF-α 水平的影响

与正常组比较，模型组TNF-α 含量显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，草果挥发油中、高剂量组TNF-α 含量显著下降(P＜0.01).结果见图9.

图9 草果挥发油对模型小鼠血清TNF-α 水平的影响( x- ±s，n ＝8)Fig.9 Effect of volatile oil from Amomum tsao-ko on the serum TNF-α levels in model mice( x- ±s，n ＝8)

3.6 分子生物学实验

根据核心靶点筛选结果，TNF、EGFR 度值最高，且与KEGG 富集分析出的多条通路相关，因此选择TNF-α、EGFR 进行WB 验证，结果如图10.与正常组比较，模型组TNF-α 蛋白表达量显著升高(P＜0.01)，EGFR 蛋白表达量显著下降(P＜0.01)；与模型组比较，草果挥发油高剂量组TNF-α 蛋白表达量显著下降(P＜0.01)，EGFR 蛋白表达量显著升高(P＜0.01).

图10 草果挥发油对TNF-α、EGFR 蛋白表达量的影响( x- ±s，n ＝3)Fig.10 Protein levels of TNF-α and EGFR( x- ±s，n ＝3)

4 讨论

急性胃炎是由于各种因素引起胃黏膜防御因子与攻击因子失衡[15]，发生胃蛋白酶、胃酸自我消化造成的胃黏膜受损[16]，病变严重者可累及黏膜下层与肌层，甚至深达浆膜层[17].目前，急性胃炎的治疗方式有除幽门螺旋杆菌的抗生素、抑制胃酸分泌药(如质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂)、胃黏膜保护药(铝碳酸镁、铋剂、瑞巴派特等)、前列腺素衍生物(米索前列醇)以及促胃肠动力药(伊托必利)等[18]，但存在不同程度副作用.中草药有多靶点、低毒性等特点，本研究选择中草药草果提取的挥发油作为研究对象，探究其对急性胃炎的作用和机制.

本研究通过GC-MS 技术鉴定出草果挥发油成分38 个，包括烯烃类、醇类、醛类等.通过构建“成分-靶点-疾病”网络，显示有24 个成分参与调控网络，其中1，8-桉叶素能够抑制由乙醇、吲哚美辛、乙醇/盐酸引起的胃溃疡形成[19]；香叶醇能通过增加黏液的产生，促进胃愈合活性；α-蒎烯可能通过抗氧化、抗炎作用对酒精性胃溃疡起到保护作用[20].可见，草果挥发油可能通过多成分共同发挥对抗急性胃炎的作用.结合PPI 结果及KEGG 分析结果，TNF-α 与47 个蛋白互相作用，参与癌症通路、化学致癌作用-活性氧信号通路、TNF 信号通路等过程；EGFR 与41 个蛋白互相作用，参与癌症通路、前列腺癌通路、化学致癌作用-活性氧等通路，因此，选择TNF-α、EGFR 进行WB 检测.

饮酒是导致胃黏膜损伤和胃肠道疾病的最常见因素，乙醇进入胃肠道，刺激胃黏膜，增加胃黏膜上皮细胞通透性，破坏胃黏膜屏障造成损伤[21].因此，本研究选择盐酸-乙醇致小鼠急性胃炎模型用于草果挥发油的作用评价.TNF-α 是由巨噬细胞、单核细胞经致炎因子刺激后所释放的一种细胞因子，能促进中性粒细胞聚集活化，增加其吞噬能力，刺激细胞分泌过氧化物，进而造成细胞死亡和组织损伤[22]，可作急性胃炎引起的炎症判断指标.HE 染色结果显示，给药组小鼠胃黏膜深层坏死、水肿、炎性细胞浸润等情况改善；ELISA 结果显示，给药组TNF-α 表达量随药量增加呈下降趋势.说明草果挥发油能有效改善胃损伤，抑制急性胃炎中炎症发生.

WB 结果显示，给药组TNF-α 蛋白表达量下降，EGFR 蛋白表达量上升.研究表明，TNF-α 表达升高会影响胃黏膜血氧供给，降低胃黏膜防御屏障作用.另一方面，TNF-α 促进炎症细胞向细胞间基质迁移，刺激成纤维细胞增殖，引发其他促炎细胞因子的产生，加剧黏膜损伤.此外，TNF-α 可激活中性粒细胞，大量中性粒细胞在胃黏膜固有层持续浸润会加剧胃黏膜损伤，影响胃溃疡的愈合质量[23].EGFR 作为胃黏膜防御因子之一，能特异性与EGF 结合，并诱导其产生变构，形成受体二聚体，激活受体酪氨酸蛋白激酶，引起自身酪氨酸被磷酸化，通过生长因子受体结合蛋白-2(Grb2)和鸟苷酸交换因子(Sos)最终激活P21ras而传送信号，发挥抑制胃酸分泌、促胃肠黏膜上皮细胞生长、增加胃黏膜血流量等作用[24]，已成为治疗胃炎、胃溃疡的新靶点.因此，草果挥发油可能通过抑制TNF-α 蛋白表达，使炎症因子释放减少、延缓促炎因子迁移趋势、减轻中性粒细胞持续浸润作用，从而减轻炎症引发的胃黏膜损伤；同时，EGFR 与EGF 特异性结合能发挥EGF 促进上皮细胞生长、增加胃黏膜血流的作用，从而提高胃黏膜防御能力和自我修复能力.

综上所述，本研究采用GC-MS 鉴定挥发油成分，借助网络药理学探究草果挥发油改善急性胃炎可能作用机制，通过药效学实验证明草果挥发油对急性胃炎改善作用，最后对关键靶点加以验证，得出草果挥发油可能通过上调EGFR 和下调TNF-α 蛋白表达发挥抗急性胃炎的作用，为进一步研究提供参考依据.