EGFR突变和CIP2A表达与肺腺癌临床特征的关系及相关性

孙晓静，陈 颖，阮 婷，吕彦天

目前肺癌的靶向治疗，尤其是EGFR-TKI治疗，可以显著提高EGFR突变患者的生存，但患者的5年生存率仍较低(10%～20%)[1]，治疗中多发生耐药[2-4]。寻找肺癌耐药的相关机制，是临床面临的迫切任务。2007年研究表明，CIP2A是一种与PP2A相互作用的内源性抑制因子，CIP2A在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，且CIP2A高表达与肺癌预后不良相关，CIP2A缺失可显著抑制癌细胞的增殖和凋亡[5-7]。激活EGFR信号可通过MEK-MAPK途径上调CIP2A表达，而CIP2A可通过PI3K-AKT途径介导厄洛替尼诱导EGFR野生型非小细胞肺癌细胞凋亡和肺癌的增殖[8-9]。本文旨在探讨肺腺癌中EGFR突变和CIP2A表达与临床病理特征的关系，为临床与病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年3月～2016年1月南京医科大学附属苏州医院经手术切除、气管镜活检及肺穿刺活检的105例肺腺癌组织。另收集78例距离癌组织边缘5 cm以上相应癌旁组织，且病理证实为正常肺组织。105例患者中，男性48例，女性57例，中位年龄57岁；吸烟者46例，非吸烟者59例；肺癌分期依据第八版UICC/AJCC分期标准：0/Ⅰ期49例，Ⅱ期24例，Ⅲ期18例，Ⅳ期14例。根据2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分类：原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)13例，微浸润腺癌(microinvasive adenocarcinoma, MIA)29例，浸润腺癌(invasive adenocarcinoma, IA)63例。本实验经南京医科大学附属苏州医院医学研究伦理委员会批准，患者均知情同意。

患者术后随访包括临床症状、肿瘤标志物、影像检查等。随访截至2021年2月，52例患者接受了辅助治疗(化疗或EGFR-TKI治疗)。其中42例患者复发，27例死亡。总生存期为确诊至患者死亡或随访结束时间，其中死亡病例通过电话随访、住院记录或入户调查确定。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 免疫组化染色采用SP法，严格按试剂盒说明进行操作，一抗CIP2A(ab84547)稀释浓度为1 ∶100。每张切片随机计数5个视野，每个视野计数200个肿瘤细胞。PBS代替一抗作为阴性对照。根据染色阳性细胞占整个癌区或良性组织的百分比评估表达分级：阴性(0～5%)、弱阳性(5%～25%)、中等阳性(26%～50%)和强阳性(51%～100%)，切片均经两名经验丰富的病理医师采用双盲法判读。

1.2.2EGFR突变检测 石蜡包埋肺癌组织以10 μm厚切片，送至病理实验室或基因公司提取DNA，并通过探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)法检测EGFR突变状态[10]。

1.2.3Western blot检测 不同肺癌细胞株A549、H1975、H460、PC-9、H520、H1975、H226、SKMES、HCC827、HCC827-GR(由苏州大学呼吸研究所惠赠)及人正常肺上皮细胞BEAS-2B培养于6孔板中，弃去培养上清，PBS清洗2次，每孔加入200 μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天公司)，轻轻摇晃1～2 min后，收集裂解液至EP管，放入100 ℃水浴中变性7 min，-20 ℃冷却备用。以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，140 mA、90 min，冰浴条件下用NC膜转膜，200 mV、120 min，快速封闭液(碧云天公司)封闭NC膜15 min，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤4次后，加入二抗(1 ∶2 000)室温孵育2～3 h，ECL发光液化学发光，放入Biorad凝胶成像仪曝光。

1.2.4CIP2A干扰细胞株的构建 靶向作用于CIP2A的siRNA慢病毒序列由上海吉满公司合成，干扰序列1：5′-AAACTTCTCTCAACATACTAGC-3′，干扰序列2：5′-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3′，对照序列：5′-CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG-3′，将肺癌H1975细胞株铺在6孔板中培养，待细胞长至板底的60%，PBS洗2次去除死细胞和代谢物，更换为2 mL含1%FBS的RPMI-1640培养基，每孔加入5 μL siRNA(空白对照及干扰序列，病毒滴度1×108TU/mL)，培养24 h后PBS洗2次，重新更换2 mL完全培养基培养，转染48～72 h后收集细胞蛋白，Western blot检测干扰效果。

1.2.5CCK-8细胞增殖实验 将构建的干扰CIP2A的肺癌细胞株H1975消化后用含10%FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为每毫升3×104个，取96孔板，根据实验不同分组，每组设4个复孔，以24、48、72及96 h为时间点。在不同时间点向待测孔中缓慢加入CCK-8试剂10 μL，继续培养2 h，酶标仪检测相应孔的OD值，并绘制增殖曲线。

1.2.6细胞周期检测 取对数生长期的干扰CIP2A的H1975肺癌细胞株，消化离心后加入1 mL冰浴预冷的PBS重悬后离心，后再加入1 mL冰浴预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4 ℃固定24 h，1 000g离心5 min，沉淀细胞。每个样品加入0.5 mL染色缓冲液，碘化丙啶染色液(1 ∶20)25 μL，RNase A(1 ∶50)10 μL。分成H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三组细胞，每组3个复孔，BD流式细胞仪根据程序设定测定各样品周期。

1.2.7细胞迁移、侵袭实验 取对数生长期的干扰CIP2A的肺癌细胞株H1975，消化离心，以无血清的RPMI-1640培养基重悬计数，每毫升1.5×105个H1975细胞接种到Tranwell上室中[侵袭实验时Transwell上室预铺50 μL Matrigel胶(1 ∶7)凝固后，每毫升加2.5×105个H1975细胞接种到Tranwell上室中]，下室加入10%FBS RPMI-1640培养基。分H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三组，每组设3个复孔，培养箱中孵育24 h，用棉签轻轻拭去上室肺癌细胞，甲醇固定30 min后，用0.1%结晶紫染色0.5 h后风干，显微镜下拍照。

1.3 统计学分析所有数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。χ2检验比较CIP2A蛋白和EGFR突变在肺腺癌和正常肺组织中的表达及与临床病理特征关系，Spearson法分析CIP2A蛋白表达与EGFR突变状态的相关性，Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，ImageJ 7.1软件测定Western blot蛋白表达的相对灰度值。肺癌细胞株组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌中CIP2A的表达CIP2A蛋白表达主要定位于肺腺癌细胞胞质中。105例肺腺癌组织中CIP2A的阳性率为64.76%(68/105)，78例癌旁组织中CIP2A的阳性率为8.97%(7/78)(图1，表1)。CIP2A在肺腺癌组织中强阳性28例，中等阳性26例，弱阳性14例，而癌旁组织中CIP2A均为弱阳性。EGFR突变型肺癌中CIP2A的表达较EGFR野生型高(图1)。χ2检验发现，CIP2A在肺腺癌组织中的阳性率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.001)。

ABCDEF

表1 肺腺癌及癌旁肺组织中CIP2A的表达

2.2 肺腺癌中EGFR突变情况ARMS法检测发现，105例肺腺癌组织中45例为EGFR野生型，60例存在EGFR突变，其中18外显子突变(G719X)2例，18和19外显子共同突变1例，20外显子突变3例，19外显子缺失(19del)33例，21外显子突变(L858R)21例。

2.3 肺腺癌中CIP2A表达与EGFR突变的相关性60例EGFR突变型肺腺癌中55例CIP2A蛋白阳性，45例EGFR野生型肺腺癌中13例CIP2A蛋白阳性。Spearson相关分析显示：肺腺癌组织中EGFR突变与CIP2A蛋白表达呈正相关(r=0.650，P<0.001，表2)。

表2 肺腺癌EGFR突变与CIP2A表达的相关性

2.4 肺腺癌患者无进展生存相关的预后因素进一步将患者年龄、性别、吸烟情况、病理分期、EGFR突变状态及CIP2A表达进行Kaplan-Meier生存分析发现，患者年龄(P=0.195)、性别(P=0.918)、吸烟状态(P=0.203)与预后无明显相关性，而病理分期(HR=5.715，95%CI=1.612～20.260，P=0.002)、CIP2A表达(HR=1.946，95%CI=0.662～5.716，P=0.015)、EGFR突变状态(HR=2.870，95%CI=1.105～7.445，P=0.037)与预后具有相关性(表3)。

表3 肺腺癌患者预后单因素分析

2.5 肺癌细胞株中CIP2A的表达本实验进一步分析CIP2A在不同肺癌细胞株和正常肺上皮细胞中的表达，发现CIP2A在肺癌细胞株中具有不同水平的表达，而正常肺上皮细胞无明显表达。ImageJ软件进一步测量CIP2A蛋白的相对表达量，在EGFR敏感突变株HCC827(19del)和PC-9(19del)中CIP2A的相对表达量分别为0.41和0.55，而在EGFR耐药突变株中H1975(T790M)中表达更高，相对表达量为0.89(图2A)。同时选取HCC827和吉非替尼诱导后耐药的HCC827-GR检测CIP2A的表达，发现吉非替尼诱导耐药后CIP2A的表达明显升高(0.56vs0.92)(图2B)。

图2 Western blot法检测肺癌细胞株中相关蛋白的表达：A. CIP2A在不同肺癌细胞株中的表达；B. HCC827及吉非替尼耐药细胞株HCC827-GR中CIP2A的表达

2.6 CIP2A干扰肺癌细胞株的构建以EGFR耐药突变株H1975为细胞系，建立干扰CIP2A的细胞株，干扰CIP2A表达后，CIP2A蛋白表达水平明显降低(相对蛋白表达量由0.81降至为0.15、0.12)，表明细胞株构建成功(3A)。应用Western blot法检测干扰CIP2A后肺腺癌常见信号通路EGFR相关信号通路PI3K及MAPK通路相关蛋白表达结果显示：干扰CIP2A后，H1975的P-AKT蛋白明显抑制(相对蛋白表达量由0.95降至0.51、0.44，而P-ERK蛋白无明显变化(蛋白表达量分别为0.81、0.79、0.83)(图3B)，表明PI3K-AKT通路可能参与肺腺癌中CI2PA介导EGFR-TKI耐药的通路。

2.7 干扰CIP2A后肺癌细胞功能实验细胞增殖：干扰CIP2A后，48 h开始H1975-Sh-1和H1975-Sh-2组细胞较H1975-Sh-NC组细胞增殖速度减慢，72 h后更为显著(H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2组的OD值分别为2.12±0.34、1.51±0.23、1.60±0.21，P<0.01)，表明干扰CIP2A可抑制肺癌细胞的增殖(图4)。

图3 A.验证干扰CIP2A肺癌细胞株构建；B.干扰CIP2A后肺癌细胞株中相关信号通路的变化

图4 干扰CIP2A对肺癌细胞增殖的影响

细胞周期：干扰CIP2A后，H1975-Sh-1、H1975-Sh-2组细胞周期G1期占(68.93±3.56)%，G2期占(3.14±0.21)%，S期占(27.11±1.53)%，H1975-Sh-NC组G1期占(57.50±2.06)%，G2期占(6.34±0.83)%，S期占(36.08±2.09)%，差异具有统计学意义(P<0.01，图5)，表明干扰CIP2A后，肺癌细胞G1期增加，S期及G2期减少，增殖受抑制。

图5 干扰CIP2A后肺癌细胞周期的变化

细胞迁移和侵袭：迁移实验显示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三组透过Transwell下室的平均每视野细胞数分别为387±46、125±29、98±17(P<0.01)；侵袭实验显示，H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1、H1975-Sh-2三组透过Transwell下室的平均每视野细胞数分别为279±35、95±28、67±12(P<0.01)，提示干扰CIP2A可抑制肺癌细胞的迁移和侵袭能力(图6)。

图6 干扰CIP2A对肺癌细胞迁移和侵袭的影响

本实验进一步用H1975-Sh-NC、H1975-Sh-1组细胞加入吉非替尼后研究干扰CIP2A后细胞增殖变化。从第3天开始H1975-Sh-1组较H1975-Sh-NC组细胞增殖速度减慢，在第4天更为明显(2.84±0.25vs1.72±0.18，P<0.01)，提示干扰CIP2A可部分恢复肺癌细胞对EGFR-TKI的敏感性(图7)。

图7 加入吉非替尼对干扰CIP2A肺腺癌细胞增殖的影响

3 讨论

目前证实CIP2A在许多实体和血液肿瘤中过表达，CIP2A过表达是胃癌、卵巢癌和舌癌等许多癌症的不良预后因素[11-12]，这可能与CIP2A和c-Myc形成的正反馈有关。目前，CIP2A在肺癌中的研究数据有限，结果也不完全一致。多数报道证实CIP2A在肺癌组织中过表达，但其与临床病理特征的关系尚不清楚。Xu等[6]研究显示，CIP2A表达与患者性别、年龄、吸烟、TNM分期、病理类型和组织学分化无关。Cha等[7]研究表明，CIP2A过表达与淋巴结转移和病理分期相关。在预后方面，多数研究显示CIP2A表达与患者预后不良相关[5-7,12]；本实验发现CIP2A在肺腺癌组织中高表达，并与患者预后相关。各研究结论不尽相同的原因可能与入组样本量、鉴定CIP2A表达的参考水平不一致以及各分期患者数量不同相关。

CIP2A具有促进肺癌增殖的作用，抑制CIP2A表达，肺癌细胞增殖受到抑制并促进凋亡的形成[8]。本实验首先通过免疫组化检测肺癌组织，发现CIP2A与EGFR突变之间具有相关性，并且CIP2A在EGFR突变型肺腺癌中的表达量相对更高，两者可能在肺癌的治疗中具有协同作用。EGFR信号通路通常由MEK-MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT信号通路介导，可促进细胞增殖、血管生成、迁移、黏附和存活[13]。研究表明[14]，CIP2A表达受EGFR-MEK-ETS1通路、p53失活、E2F1和ATF-2(激活转录因子2)调控，因此，推测EGFR可以通过MEK-MAPK途径促进CIP2A在肿瘤中的表达，而EGFR突变型比EGFR野生型更有能力激活下游信号通路。在EGFR野生型患者中，厄洛替尼与多西他赛或培美曲塞的疗效差异无统计学意义(P=0.37)，表明EGFR-TKI在肺癌治疗中的作用不一定完全依赖EGFR突变，而这种抗肿瘤作用可能与抑制CIP2A蛋白有关[8]。因此，有必要从分子水平进一步研究EGFR突变(包括耐药突变)和CIP2A在肺癌细胞增殖和侵袭中的作用。

EGFR是近年来在治疗晚期肺癌中发现的最具治疗性的分子标志物。EGFR-TKI已成为EGFR突变晚期肺癌患者一线治疗的首选。然而，绝大多数患者在获得9.2～19.3个月的无进展生存期后，不可避免地因后续继发耐药而导致疾病进展[2-3]。目前关于EGFR-TKI继发耐药的机制已有大量研究报道[15-16]，主要分为EGFR依赖型和EGFR非依赖型。EGFR-T790M突变是第一、二代EGFR-TKIs EGFR依赖性获得性耐药最主要的原因，占50%～60%[17-18]。其耐药机制为当EGFR-T790M突变时，EGFR蛋白ATP结合囊中的T790M残基可增强其与ATP的亲和力，从而介导EGFR-TKI的抗性并降低其疗效[19]。H1975细胞株是具有T790M突变的肺腺癌细胞株，故选用H1975细胞株作为本实验后续的CIP2A干扰细胞株。本实验发现，干扰CIP2A后肺癌细胞株表现为抑制肿瘤增殖、迁移及侵袭的表型变化。为进一步研究哪些信号通路参与此种改变，本实验应用Western blot法检测常见的EGFR相关信号通路PI3K及MAPK通路相关蛋白表达，结果显示：干扰CIP2A后，肺癌细胞中P-AKT蛋白明显抑制，而P-ERK蛋白无明显变化，表明PI3K-AKT通路可能参与了CI2PA介导EGFR-TKI耐药的通路。PI3K是细胞内脂质激酶家族的成员，其中PIK3α可以PIP2磷酸化为PIP3，后者能够激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，进而调节肿瘤细胞增殖能力。有研究显示PI3K-AKT/mTOR通路激活可能与EGFR耐药相关，发生率为4%～11%，其中包括E545K、E542K、R88Q、N345K和E418K突变[20]。

另外，Saafan等[21]在适应厄洛替尼的非小细胞肺癌细胞系HCC4006rErlo0.5中发现，构成细胞增殖调节CIP2A的基因表达明显升高，可作为获得性耐药的模型，并且CIP2A可导致AKT信号的结构性激活，本实验结论与之一致。除了肺癌，在乳腺癌研究中[22]，CIP2A过表达使乳腺癌细胞株SKBR3和78617对拉帕替尼(ErbB2/EGFR抑制剂)诱导的细胞凋亡和生长抑制具有抗性；相反，通过慢病毒shRNA干扰CIP2A可增强细胞对拉帕替尼诱导的生长抑制和细胞凋亡的敏感性。这些研究表明，CIP2A在EGFR-TKI继发的耐药研究中具有更进一步深入研究的价值。

综上，肺腺癌中CIP2A表达明显增加，并与EGFR突变呈正相关。EGFR-TKI耐药可能与CIP2A高表达有关，干扰CIP2A可能成为肺癌靶向治疗的新思路，未来仍需要进一步探讨CIP2A在肺癌EGFR突变耐药方面的机制。