人参粉长期喂养去卵巢大鼠对其肝铁代谢影响的初探

陈 蕾，李 楠，张 琨

(吉林大学第二医院 1.检验科，2.研究中心，吉林 长春130041)

雌激素一方面在女性成长发育和某些疾病的发生发展中起着重要的作用，另方面也做为某些疾病的治疗方法。但长期使用雌激素可导致机体处于高凝状态、高血压、水肿等，甚至引起一些雌激素依赖性肿瘤[1]。2017年世卫组织癌症研究机构将雌激素-孕激素合用治疗列在一类致癌物清单。为寻求新的雌激素替代物，作用温和、有效的中药植物性雌激素成为研究热点[2]。

作为我国传统道地中药材，人参的雌激素样作用已有研究，其某些提取成分或作用于雌激素受体，可以缓解绝经期症状、出血障碍、睡眠障碍、抑郁和焦虑[3]。近年人参经不同提取方法获得的单体成分研究取得了很大进展:人参皂苷(Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg3、Rh2)属于三萜类，Rb1、Rg1、Rh具有雌激素样作用并激活雌激素受体[3]；其中Rb3可以通过雌激素受体起到保护血管内皮的作用[1]。另外也有研究者发现人参可以恢复去卵巢小鼠的发情期，缓解生殖靶组织的萎缩。雌激素信号通过与ERα结合调节脂肪积累和体重，人参作为一种植物雌激素也能显著抑制OVX小鼠的体重增加，并上调其靶组织ERα的表达[3]。这方面我们也已通过系列试验得以一定证实，并同时进行了内分泌、脂代谢等方面的研究，初步确认了长期食用人参粉可能改善绝经期综合征的潜在能力，但具体作用机制仍有待深入研究并完善。

铁是人体中必不可少的微量元素,它参与DNA的合成,蛋白质的形成,氧的运输和能量代谢等活动,因而维持体内铁平衡是至关重要的。近年研究发现铁代谢失衡与多种雌激素代谢疾病(如骨质疏松、乳腺癌、卵巢癌、神经退行性病变、子宫内膜异位症等)相关[4]。铁代谢的调控机制逐渐被深入认识。铁调素(Hepcidin)是全身铁平衡的关键调节因子，Hepcidin-膜铁转运蛋白(Ferroportin,FPN)轴主要维持系统铁稳态[5]。FPN是哺乳动物细胞中唯一已知的铁输出蛋白，在肠上皮细胞、肝细胞和巨噬细胞中均有显著表达。Hepcidin的增加诱导FPN内化和泛素介导降解，导致十二指肠铁吸收减少，巨噬细胞的铁出口受限，导致血清铁减少，同时导致脾脏等器官的铁滞留[6]。其中雌激素对铁代谢的调控为某些疾病的治疗提供了新思路。在Hepcidin的多条调控机制中，骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)的研究相对比较成熟，而且其在骨质疏松、乳腺癌、神经退行性病变等中均有涉及。本研究期望通过人参粉对Hepcidin、FPN、BMP6 mRNA的可能影响为进一步探究人参更广泛的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 受试样品人参粉，为吉林产5年生晒参粉，淡黄色粉末状。

1.2 主要试剂与仪器

TriQuick Reagent总RNA提取试剂(北京索莱宝)、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、DEPC水、引物合成(均为上海生工生物有限公司)、LightCycler480荧光定量PCR仪(美国罗氏)、分光光度计(美国赛默飞)、日立008自动生化分析仪、美国伯腾仪器有限公司多功能酶标仪(型号：Synerggy HT)。

1.3 实验方法

1.3.1实验动物饲养及处理 基础饲料及雌性Wistar 大白鼠购于长春亿斯试验动物技术有限责任公司，体重(180-220)g，共50只。环境温度20-22 ℃，湿度55%-65%。动物购入后观察饲养3 d，随机分为2个对照组及3个受试物组，其中4组行去卵巢手术，1组行假手术;假手术组按去卵巢手术组找出双侧卵巢，不去除，缝合即可。各组缝合完毕后给予头孢0.5 ml/100 g，恢复3 d 后行人参粉喂养试验。大鼠基础饲料摄入量按体重10%计算，参考新版药典日允许摄入人参量设高剂量3 g/kg BW，另设1、0.5 g/kg BW为中、低剂量。受试物人参粉均匀地掺入基础饲料，对照组喂饲基础饲料。单笼喂养，自由饮食，记录大鼠进食量、体重，连续观察90 d，结束试验前16 h禁食，之后用1% 戊巴比妥钠生理盐水溶液，按5 ml/kg BW腹腔注射麻醉，下腔静脉采血,3 000 r/min 离心15 min，取上层血清用于相关指标检测;心脏灌洗后取大鼠肝脏、子宫、脑等器官称重并计算脏/体比值，后用PBS冲洗干净，迅速置于经DEPC处理过的1.5 ml离心管中，冻存于-80℃冰箱中，用于测定铁相关通道蛋白mRNA水平。

1.3.2血清指标测定 全自动生化分析仪测定铁代谢相关指标；波长450 nm条件下Elisa法测定血清雌激素。

1.3.3RT-PCR测定肝匀浆铁代谢相关基因mRNA水平 冻存于-80℃冰箱中肝脏组织切取约黄豆大小置于离心管，向每一离心管中加入1 ml的Trizol 试剂，匀浆。提取总RNA，取1 μg RNA，用逆转录试剂盒建立逆转录体系进行cDNA 逆转录。以上述cDNA 产物为模板，用相关引物(表1) 进行RT-PCR 扩增。以β-actin基因为内参。

表1 Hepcidin、BMP6、FPN、β-actin基因的引物序列

1.4 统计学处理采用SPSS26.0进行数据处理，数据以均数±标准差表示。各组间运用one-way ANOVA 进行比较，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

表2可见去卵巢大鼠雌激素明显下降，体重明显增加，子宫/体重比值下降。随人参粉剂量的增加，剂量组对去卵巢的补偿作用逐渐增加。给予人参3.0 g/kg BW的去卵巢大鼠能够很大程度上抑制体重增加、生殖靶器官的萎缩，减轻雌激素降低带来的生理危害。

表2 长期喂养人参粉对去卵巢大鼠雌激素、体重及子宫系数的影响

表3可见 各组血清铁代谢指标无明显差别。

表3 长期喂养人参粉对去卵巢大鼠血清铁代谢生化的影响

表4、图1可见 与假手术组相比，去卵巢后肝脏Hepcidin表达水平明显降低，FPN mRNA的表达水平升高，BMP6 mRNA表达水平有所降低；在对给予不同剂量人参粉组与去卵巢对照组比较后发现，仅在给予高剂量人参粉时Hepcidin的升高与去卵巢组比有统计学意义。而在人参对FPN的调控中发现，中、高剂量组可缓解去卵巢后的升高水平，其中高剂量组的缓解作用更强，BMP6 mRNA表达水平除假手术组与去卵巢组比较差异有统计学意义外其他各组未见明显差异。

注：与去卵巢对照组比较△△P<0.01,△P<0.05。与假手术组比较**P<0.01；*P<0.05.

表4 各组大鼠铁代谢相关基因mRNA表达

3 讨论

本研究去卵巢建立绝经模型，探究绝经后雌激素、铁等相关指标的变化及给予人参粉后是否可改善机体状态。经检测去卵巢后雌激素水平降低，体重明显增加，子宫/体重比明显降低，镜下观察到去卵巢对照组子宫内膜萎缩，表面光滑，未见透亮细胞，宫内膜腺体数量极少，平滑肌呈现明显萎缩证实了子宫萎缩，而当给予人参粉3.0 g/kgBW时可改善这些不良影响，体现了人参的雌激素样作用。

铁代谢方面检测结果发现，各组血清铁代谢指标无明显差别。但其肝脏铁代谢相关基因mRNA的表达水平在个别或多个组间存在差异。结合文献报道高铁去势建立小鼠骨质疏松模型中去势时间(7周)及去势小鼠的月龄(12周)对模型的建立都有影响[7]，分析可能是建立去卵巢模型后继续长期喂养人参粉试验，一方面动物机体内部调控发挥了一些作用，具体机制有待进一步探讨，另一方面人参粉须经胃肠代谢以及肝肠循环吸收，首先直接作用于铁代谢的关键脏器肝脏组织的关键调控基因Hepcidin，进行了一系列脏器组织铁代谢调控，并未影响至外周循环。本研究结果显示，去卵巢对照组Hepcidin mRNA水平低于假手术组。给予高剂量人参粉后Hepcidin mRNA的水平较去卵巢对照组升高，且与假手术组较接近，说明人参粉在一定程度上纠正了去卵巢后Hepcidin的降低。Hepcidin-FPN轴是在铁稳态中发挥重要作用，当Hepcidin降低时对FPN的内化、降解作用减弱，FPN水平升高，使集聚在组织细胞内的铁外排。本次研究结果也体现了这个变化过程，在Hepcidin降低的去卵巢对照组FPN表达水平增加了，而高剂量人参在一定程度上降低由此造成的FPN调控性升高，使之接近假手术组。与刘禄林[8]等研究中大鼠去势后肝脏Hepcidin mRNA 表达下调,十二指肠FPN1表达上调也是一致的。

在绝经后骨质疏松、神经退行性病变、心血管疾病等雌激素相关疾病中，铁过载是危险因素。研究者们发现GPR30-BMP6可参与雌激素对Hepcidin的调控[9]、BMP6可直接或经BMP6/Smad等调节Hepcidin。在本研究中，与假手术大鼠相比，去卵巢对照组大鼠肝脏中BMP6的表达明显降低。各剂量组人参粉对BMP6表达无明显影响。查阅文献发现染料木素(一种植物雌激素)是雌激素的良好替代品，其对Hepcidin的影响不通过雌激素受体和细胞铁的增加，而是通过上调几个Stat3参与的信号通路的转录本水平来增加人肝细胞hepcidin的表达，但这些转录本未被BMP6上调[10]。而人参根中的Rg1具有与染料木素一样的雌激素样作用[11]。由此我们推测人参粉可能也通过Stat3相关通路参与肝脏Hepcidin表达，本研究结果未见人参对BMP6的明显作用。

综上所述，去卵巢使雌激素骤然撤退，即生成迅速减少导致外周循环骤然降低进而需要卵巢外的其它合成雌激素器官作进一步调整补充，反应时间可能会更长或者造成不可逆影响；而此时长期给与人参粉则可以借助摄入体内类雌激素样物质由内而外的调控整个机体所有雌激素相关代谢，本研究主要关注了参与铁代谢脏器尤其是肝脏以及外周循环激素水平和铁代谢水平，人参粉的作用应该是更加深入、全面和持续。但雌激素对铁代谢影响是双向的、多通路的，未来我们希望能通过深层次多方面的机制通路(如Jak/Stat3,缺氧诱导因子/缺氧反应元件,IL-6家族/Stat等)研究更明确人参粉的应用价值，找到更合理预防性给予人参粉的剂量，尽早将其应用于预防围绝经期乃至衰老后的一些症状。