三棱中含氮类成分的研究

邓可众， 刘 聪， 杨 堃， 宗 琪， 王雨晴， 熊 英*

(1.江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004；2.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121)

三棱为黑三棱科黑三棱属植物黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥块茎, 具有破血行气、消积止痛之效,用于治疗癥瘕痞块、痛经、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛[1]。三棱含有苯丙素、黄酮、生物碱、三萜以及环二肽等多种成分[2]，目前有关苯丙素类(如阿魏酸蔗糖酯衍生物)的研究较多[3-4]，但仅报道了5个生物碱[2,5]、3个环二肽[6]，其中环(苯丙氨酸-酪氨酸)的抗凝效果显著，铝络合生物碱Grailsine-Al-glycoside具有抗HeLa宫颈癌活性[5]，表明该类含氮化合物也是三棱药效成分。本实验主要报道三棱中含氮类成分，以期为其活性成分的阐明、药材及相应制剂质量标准的提高及开发利用奠定基础。

1 材料

Avance HD型核磁共振仪 (德国Bruker公司，600 MHz)；BS224S电子分析天平(德国赛多利斯公司)；EYELA 1100旋蒸仪(上海爱朗仪器有限公司)；ZF-1三用紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；Triple TOF 5600 质谱仪(美国AB SCIEX公司)；Waters 2489 Alliance Separations Module制备HPLC仪(美国Waters公司)；ODS-AQ色谱柱(20 mm×250 mm，5 μm，日本YMC公司)。Sephadex LH-20(美国Amersham公司)；XAD-16大孔树脂(美国罗门哈斯公司)；GF254薄层硅胶 (青岛海洋化工厂)；柱色谱硅胶 (100～200、200～300目，青岛海洋化工厂)。纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；色谱纯甲醇 (国药集团上海有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷等试剂均为分析纯；显色试剂为10%硫酸乙醇、2%茚三酮试剂以及改良碘化铋钾。

三棱于2016年购于江西省樟树药材市场，经重庆市食品药品检验检测研究院杨堃副主任药师鉴定为黑三棱科黑三棱属黑三棱SparganiumstoloniferumBuch.-Ham.的干燥块茎。

2 提取与分离

取三棱干燥块茎40 kg，粉碎后用95%、65%乙醇依次渗漉提取，减压浓缩得浸膏2.7 kg，加水混悬，水饱和的石油醚、乙酸乙酯(约30 L)依次萃取，减压浓缩得石油醚层80 g、乙酸乙酯层180 g。取乙酸乙酯层浸膏180 g，经ODS柱以甲醇-水梯度洗脱，得12个流分，其中第9流分(2.4 g)经硅胶柱以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，再经制备HPLC甲醇-水(4∶6)纯化得化合物1(26.6 mg)。乙酸乙酯萃取后的剩余物采用大孔树脂柱分离，以水及30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脱，30%乙醇洗脱部分经开放ODS柱分离以甲醇-水(2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0)梯度洗脱，得到15个组分，其中组分2析出结晶，再经重结晶得化合物8(2.0 mg)；组分3经Sephadex LH-20甲醇-水(6∶4)洗脱，得化合物4(10.5 mg)、5(2.0 mg)；组分4经Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脱，再经制备HPLC以甲醇-水(2∶8)纯化得化合物2(9.2 mg)、3(13.7 mg)；组分5经Sephadex LH-20以甲醇-水(6∶4)洗脱，再经制备HPLC以甲醇-水(2∶8)纯化得化合物6(7.9 mg)。将50%乙醇洗脱部分经硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(5∶1、4∶1、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、0∶1)梯度洗脱，共得到12个组分，第2组分经Sephadex LH-20柱层析以甲醇-水(6∶4)洗脱，再经MCI柱层析以甲醇-水(0∶1～1∶0)梯度洗脱，重结晶纯化得化合物7(180 mg)、9(34 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色油状物，ESI-MSm/z239.2[M+H]+，分子式C12H17NO4。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 9.46 (1H, s, H-6′)，7.01 (1H, d,J=4.2 Hz, H-3′)，6.31 (1H, d,J=4.2 Hz, H-4′)，4.51 (2H, s, H-7′)，4.38 (2H, m, H-4)，3.68 (3H, m, H-5)，3.37 (3H, s, H-8′)，2.38 (2H, t,J=7.2 Hz, H-2)，2.03 (2H, m, H-3)；13C-NMR (CD3OD，150 MHz)δ: 174.2 (C-1)，30.8 (C-2)，26.6 (C-3)，45.0 (C-4)，51.3 (C-5)，133.0 (C-2′)，125.1 (C-3′)，112.1 (C-4′)，140.2 (C-5′)，180.3 (C-6′)，65.5 (C-7′)，57.4(C-8′)。以上数据与文献[7]基本一致，故鉴定为methyl4-[formyl-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoate。

化合物2：淡黄色针状结晶，ESI-MSm/z：231.1[M-H]-，分子式C13H16N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 1.76 (3H，d，J=7.2 Hz, H-10), 3.04 (1H, m, H-4a), 3.46 (1H, dd,J=4.8, 16.8 Hz, H-4b), 3.98 (1H, m, H-3), 4.73 (1H, d,J=6.6 Hz, H-1), 7.07 (1H, t,J=7.2 Hz, H-6), 7.16 (1H, t,J=7.2 Hz, H-7),7.36 (1H, d,J=7.8 Hz, H-8), 7.50 (1H, d,J=7.8 Hz, H-5);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 17.1 (C-10), 24.3 (C-4), 51.1 (C-1), 59.8 (C-3), 107.9 (C-4a), 112.3 (C-8), 119.2 (C-5), 120.6 (C-6), 123.3 (C-7), 127.5 (C-4b), 131.4 (C-8a), 138.6 (C-9a), 173.4 (C-11)。以上数据与文献[8]基本一致，故鉴定为(1S,3S)-1,2,3,4-tetrahydro-1-methyl-β-carboline-3-carboxylic acid。

化合物3：淡黄色针状结晶，茚三酮不显色，薄层原位水解反应显阳性，提示为肽类。ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C14H16N2O4。13C-NMR中有2个酰胺羰基碳的特征信号δ168.6，168.1，推测为环二肽。1H-NMR中的δH7.23 (2H, m, H-9,13), 7.32 (2H, m, H-10,12), 7.26 (1H, m, H-11)为单取代苯环的5个质子信号，对应的6个芳环碳信号为δC134.9 (C-8), 130.3 (C-9,13), 128.5 (C-10,12), 127.5 (C-11)，1H-1H COSY谱显示1个亚甲基δH2.98 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b)，3.30 (1H, m, H-7a)和1个次甲基δH4.34 (1H, m, H-3)具有邻位偶合的关系，HMBC谱显示该3个氢质子与苯环上的δC134.9 (C-8)及酰胺羰基碳δC168.6均有远程相关，以上NMR数据与苯丙氨酸[9]十分相似，推测分子中存在1个苯丙氨酸片段；此外，1H-NMR中显示1个次甲基质子信号δH3.83 (1H, m, H-6)，高场部分还有2个亚甲基质子信号δH1.32 (1H, m, H-14a), 0.98 (1H, m, H-14b), 1.88 (2H, m, H-15)。1H-1H COSY 谱显示亚甲基δH1.32，0.98与亚甲基δH1.88和次甲基δH3.82 均有偶合关系，表明结构中存在-CH-CH2-CH2-基团；13C-NMR中除酰胺羰基碳信号δC168.6外，还可见δC174.8 (C-16)的羧基碳信号，HMBC 谱显示2个羰基碳δC174.8、168.1与亚甲基δH1.32，0.98、亚甲基δH1.88均有远程相关，推测分子中还存在1个谷氨酸结构片段，故鉴定为环(谷氨酸-苯丙氨酸)，该化合物已有人工合成的报道，本实验所得为新天然产物，其结构见图1，NMR数据见表1。

图1 化合物3结构和主要HMBC与1H-1H COSY相关Fig.1 Structure and correlations between key HMBC and 1H-1H COSY of compound 3

表1 化合物3的1H-NMR(600 MHz，CD3OD)及13C-NMR(150 MHz，CD3OD)数据

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z：261.1[M+H]+，分子式C15H20N2O2。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.33 (1H, m, H-3), 3.82 (1H, m, H-6), 3.30 (1H,J=3.6, 13.8 Hz, H-7a), 2.94 (1H, dd,J=4.8, 13.8 Hz, H-7b), 7.22 (2H, m, H-9,13), 7.29 (2H, m, H-10,12), 7.21 (1H, m, H-11), 0.88 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.42(1H, m, H-15), 0.75 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.73 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-2), 57.3 (C-3), 169.2 (C-5), 54.1 (C-6), 39.4 (C-7), 136.5 (C-8), 131.6 (C-9,13), 129.7 (C-10,12), 128.6 (C-11), 45.2 (C-14), 24.7 (C-15), 23.4 (C-16), 21.4 (C-17)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为环(亮氨酸-苯丙氨酸)。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：180.1[M-H]-，分子式C9H11NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ:6.99 (2H, d,J=8.4 Hz, H-2′,6′), 6.71 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3′,5′), 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-2), 2.80 (1H, dd,J=3.6, 14.4 Hz, H-3a), 2.42 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 170.7 (C-1), 127.1 (C-1′), 132.8 (C-2′,6′), 116.4 (C-3′,5′), 158.1 (C-4′), 57.6 (C-2), 50.5 (C-3)。以上数据与文献[11]基本一致，故鉴定为酪氨酸。

化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z：164.2[M-H]-，分子式C9H11NO2。1H-NMR (D2O, 600 MHz)δ: 7.32～7.21 (5H, m, H-2′,3′,4′,5′,6′), 3.88 (1H, m, H-2), 3.17 (1H, m, H-3a), 3.01 (1H, m, H-3b);13C-NMR (D2O, 150 MHz)δ: 173.9 (C-1), 58.0 (C-2), 36.3 (C-3), 135.0 (C-1′), 129.3 (C-2′,6′), 129.1 (C-3′,5′), 127.6 (C-4′)。以上数据与文献[9]基本一致，故鉴定为苯丙氨酸。

化合物7：白色针状结晶，ESI-MSm/z：130.1[M+H]+，分子式C5H7NO3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.27 (1H, dd,J=4.8, 9.0 Hz, H-5), 2.51 (1H, m, H-3a), 2.36 (2H, m, H-4), 2.19 (1H, m, H-3b);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 179.7(C-2), 174.3 (C-6), 55.6 (C-5), 29.0 (C-3), 24.7 (C-4)。以上数据与文献[12]基本一致，故鉴定为焦谷氨酸。

化合物8：淡黄色针状结晶，ESI-MSm/z：275.1[M-H]-，分子式C15H20N2O3。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ: 4.03 (1H, t,J=3.6 Hz, H-3), 3.45 (1H, m, H-6), 3.10 (1H, dd,J=3.6,14.4 Hz, H-7a), 2.78 (1H, dd,J=4.8, 14.4 Hz, H-7b), 6.79 (2H, d,J=8.4 Hz, H-9,13), 6.51 (2H, dd,J=8.4 Hz, H-10,12), 0.68 (1H, m, H-14a), 0.11 (1H, m, H-14b), 1.22 (1H, m, H-15), 0.65 (3H, d,J=6.6 Hz, H-16), 0.63 (3H, d,J=6.6 Hz, H-17);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 168.7(C-2), 55.6 (C-3), 167.1(C-5), 52.1(C-6), 37.4(C-7), 125.1(C-8), 130.8 (C-9,13), 114.4 (C-10,12), 156.1 (C-11), 43.2 (C-14), 22.7 (C-15), 21.4 (C-16), 20.3(C-17)。以上数据与文献[13]基本一致，故鉴定为环(亮氨酸-酪氨酸)。

化合物9：白色粉末，ESI-MSm/z：268.1[M+H]+，分子式C10H13N5O4。1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ: 8.23 (1H, s, H-8)，8.02 (1H, s, H-2)，7.26 (2H, s, NH2)，5.74 (1H, d,J=6.0 Hz, H-1′), 4.48 (1H, dd,J=11.4,6.0 Hz, H-2′)，4.02 (1H,brs, H-3′), 3.84 (1H, d,J=3.6 Hz, H-4′), 3.55 (1H, m, H-5′a), 3.45 (1H, m, H-5′b), 5.36 (1H, d,J=6.0 Hz, 2′-OH), 5.32 (1H,brs, 3′-OH), 5.10 (1H, d,J=4.2 Hz, 5′-OH)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ: 153.8 (C-2), 150.4 (C-4), 120.8 (C-5), 155.6 (C-6), 141.4 (C-8), 89.3 (C-l′), 74.9 (C-2′), 72.1 (C-3′), 87.3 (C-4′), 63.0 (C-5′)。以上数据与文献[14]基本一致，故鉴定为腺苷。

4 讨论

前期课题组对三棱粗提物进行家兔体外APTT(活化部分凝血酶原时间)检测，发现三棱石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位及水部位具有较好的抗凝活性，时间分别为16.4、22.0、21.7、27.5 s(空白为13.3 s)，故本实验对乙酯部位和乙酸乙酯萃取后剩余的极性较大部位(正丁醇、水)化学成分进行研究，从中分离鉴定了9个含氮化合物，其中化合物3为新天然产物，1～2、4～7为首次从该属植物中分离得到。环二肽类成分的薄层层析直接采用茚三酮试剂无法显色，参考文献[15]的原位水解法即先用浓盐酸水解，然后再喷洒茚三酮试剂的显色方法。生物碱、环二肽均为三棱中活性成分类型[5-6]，本实验为活血中药三棱药效物质的全面阐明提供了化学成分基础。