HPLC-UV-ELSD法同时测定防风通圣丸中8种成分

赵 迪， 刘学芳， 董浩然， 冯素香， 李璐睿惠

(河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 450046)

防风通圣丸由防风、川芎、当归等17味药材组成，可疏风清热、解表通里，对表里俱实、风热壅盛之症疗效显著。方中麻黄、防风、薄荷、荆芥可祛除外感风邪，石膏、黄芩、连翘、栀子可清除热邪，桔梗、滑石、大黄、芒硝通过祛痰、利尿促便等方法清除内邪，川芎、当归、白芍功效活血祛瘀、补血养阴，配以白术、甘草补气扶正[1-2]，不仅可作为春季防疫药物服用，而且对高血压、过敏性皮肤病、中风、部分炎症性疾病均有治疗作用[3-6]。

防风通圣丸组方药味多，化学成分复杂，全面稳定的质量控制方法是对其品质的重要保证，2020年版《中国药典》收载了方中黄芩主要成分黄芩苷的含量测定方法，而近年来相关文献大多侧重连翘、黄芩、大黄蒽醌等祛邪药味的质量控制，尚未涉及祛痰药桔梗、活血补气药川芎等[7-9]。因此，本实验采用HPLC法同时测定防风通圣丸中川芎、防风、桔梗、甘草、栀子、黄芩主要成分川芎嗪、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桔梗皂苷D、甘草苷、栀子苷、黄芩苷、黄芩素的含量，以期为完善该制剂质量控制标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪系统、2000ES蒸发光散射检测器(美国Thermo Fisher公司)；XS105型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试剂与药物 栀子苷(批号MUST16020401，纯度≥98%)对照品购于成都曼思特生物科技有限公司；川芎嗪(批号CHB180528，纯度≥98%)、甘草苷(批号CHB180608，纯度≥98%)、升麻素苷(批号CHB190103，纯度≥98%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号CHB180318，纯度≥98%)、黄芩苷(批号CHB190115，纯度≥98%)、桔梗皂苷D(批号CHB190123，纯度≥98%)、黄芩素(批号CHB190116，纯度≥98%)对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司。防风通圣丸购于太极集团四川绵阳制药有限公司(6 g/袋，批号1809009、1904007、2003005)。乙腈(批号163602)、甲醇(批号16086029)购于美国Tedia公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%醋酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，95%～80%B；20～40 min，80%～70%B；40～55 min，70%～60%B；55～65 min，60%～95%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长260 nm；ELSD漂移管温度90 ℃；雾化气体积流量2.5 mL/min；雾化温度36 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取川芎嗪、栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、桔梗皂苷D、黄芩素对照品适量，甲醇稀释定容，精密吸取适量至量瓶中，甲醇稀释定容，即得(各成分质量浓度分别为川芎嗪95.62 μg/mL、栀子苷95.38 μg/mL、升麻素苷26.81 μg/mL、甘草苷183.8 μg/mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷24.38 μg/mL、黄芩苷285.0 μg/mL、桔梗皂苷D 522.0 μg/mL、黄芩素29.38 μg/mL)，密封冷藏。

2.2.2 供试品溶液 取本品适量，研细混匀，精密称取粉末1 g至锥形瓶中，加入80%甲醇25 mL，密塞摇匀并浸泡20 min，称定质量，超声(200 W、40 kHz)提取30 min，摇匀，冷却，80%甲醇补足减失的质量，4 000 r/min离心，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照本品处方，分别制得缺防风、缺栀子、缺川芎、缺桔梗、缺黄芩、缺甘草的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰均达到基线分离(分离度大于1.5)，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，甲醇稀释定容至不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以桔梗皂苷D质量浓度对数值或其他7种成分质量浓度为横坐标(X)，桔梗皂苷D峰面积对数值或其他7种成分峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 稳定性试验 取本品适量(批号1809009)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得川芎嗪、栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、桔梗皂苷D、黄芩素峰面积RSD分别为1.91%、0.97%、1.33%、2.69%、1.38%、2.01%、1.56%、2.47%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得川芎嗪、栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、桔梗皂苷D、黄芩素峰面积RSD分别为0.83%、1.98%、0.76%、0.97%、1.21%、1.64%、1.29%、0.87%，表明仪器精密度良好。

1.川芎嗪 2.栀子苷 3.升麻素苷 4.甘草苷 5.5-O-甲基维斯阿米醇苷 6.黄芩苷 7.桔梗皂苷 8.黄芩素1.ligustrazine 2.gardenoside 3.prim-O-glucosylcimifugin 4.glycyrrhizin 5.5-O-methylvisamitol side 6. baicalin7.platycodin D 8.baicalein图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系

2.7 重复性试验 取本品适量(批号1809009)，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得川芎嗪、栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、桔梗皂苷D、黄芩素峰面积RSD分别为1.24%、0.88%、0.79%、1.12%、1.63%、0.97%、1.08%、1.91%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品适量(批号1809009)，研细混匀，精密称取0.50 g粉末至锥形瓶中，共6份，精密加入对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，川芎嗪、栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、桔梗皂苷D、黄芩素平均加样回收率分别为99.60%、99.49%、99.80%、99.48%、100.07%、99.35%、99.44%、99.58%，RSD分别为0.52%、1.12%、0.97%、1.10%、1.14%、0.77%、1.23%、1.31%。

2.9 样品含量测定 取本品3批，每批3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。2020年版《中国药典》规定，每1 g防风通圣丸含黄芩以黄芩苷计不得低于6.1 mg，本实验发现3批样品中黄芩苷含量均高于6.1 mg，符合相关要求。

3 讨论

药理研究表明，升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷这2种色原酮是防风发挥祛风解热作用的主要活性成分，川芎嗪是评价川芎生物碱含量高低的重要指标，2020年版《中国药典》分别将桔梗皂苷D、黄芩苷、栀子苷、甘草苷作为桔梗、黄芩、栀子、甘草质量标志物进行控制[10-13]。因此，本实验选择防风通圣丸中上述成分(结合黄芩另一主要成分黄芩素)作为指标进行含量测定。

表2 各成分含量测定结果(n=3)

本实验在筛选色谱条件时，考察了提取溶剂甲醇、50%甲醇、80%甲醇，发现80%甲醇提取时回收率高，杂质峰较少。再考察了检测波长，由于各成分紫外吸收波长差异较大，故设定240、260、280 nm三波长通道，发现它们在260 nm处信号均较强，可有效分离，同时桔梗皂苷D共轭结构较少，紫外吸收弱，故联用蒸发光散射检测器对其进行测定；最后考察了流动相乙腈-水、甲醇-水，发现前者洗脱时分离效果较好，并通过调节pH来改善峰形，最终选择乙腈-0.1%醋酸进行梯度洗脱[14-18]。