盐碱地盐生植物根际耐盐促生菌的筛选及鉴定

梁翔宇，顾 欣，刘文辉，孙小涵，白宇馨，马 艳，李 茜，赵 莹

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

盐碱化是全球耕地土壤面临的重要问题之一[1]。为了利用盐碱化耕地并减少土壤盐碱化程度，人们采用了许多土壤改良方法。其中，生物措施被认为是较为有效且环境友好的措施[2]。例如，使用生物有机肥可显著改善盐碱地的土壤性质[3]，施用菌剂可以促进作物在盐碱化土壤中生长等[4—5]，生物有机肥和菌剂中的耐盐碱有益功能菌发挥了重要作用[6]。因此，分离获得耐盐碱性良好、可促进植物生长的功能微生物对盐碱地改良及新型菌剂的开发具有重要意义。

根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）是指存在于植物根际周围的一类可以促进植株生长，提高植株抗病性的微生物[7]。其对植物生长和土壤改良均具有重要作用[8]。针对盐碱地植物生长和土壤改良需求，耐盐碱的PGPR逐渐成为研究热点。有研究者利用三级筛选体系从新疆碱蓬（Suaeda glauca）根际土壤中分离获得PGPR菌，包括芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、盐芽孢杆菌（Halobacillus sp.）、肠杆菌（Enterobacter sp.）和节杆菌（Arthrobacter sp.）[9]；从滨海盐碱地的非盐生植物根际土壤中筛选获得了耐盐促生芽孢杆菌B.megaterium T1-8菌株和B.paraflexus T4-9菌株[10]；从新疆盐爪爪（Kalidium foliatum）根际土壤中分离获得了57株细菌，分属4个门12个属，且多数菌株兼有耐盐和促生作用[11]。以上研究说明，盐碱地土壤中具有丰富的PGPR资源，有待进一步开发。

银川平原位于我国西北部，由于气候、地质和人为干扰等原因，土壤易发生盐碱化[12]。因此，当地对耐盐碱PGPR资源的开发和利用存在需求。本实验通过采集宁夏银北盐碱地盐生植物根际土壤，利用选择培养法分离筛选耐盐碱的根际促生细菌，对其进行分类鉴定，并检测其促生作用和盐碱耐受性，期望为有益功能菌的开发利用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土样采集2019年10月，选择宁夏银北地区平罗县西大滩和惠农区礼和乡2个盐碱地区，以碱蓬、盐爪爪和芦苇（Phragmites communis）为优势种的区域，挖取植株，尽量保留根系和根际土壤，装于密封袋中带回实验室。利用抖根法采集植物根际土壤，用于目标微生物的分离筛选。

1.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基[13]、阿须贝培养基[14]、解磷菌筛选培养基[15]、解钾菌筛选培养基[16]、LB培养基[17]、CAS培养基[18]。

1.1.3 主要仪器超净工作台（SW-CJ-2FD，上海博迅实业有限公司）；振荡培养箱（ZD-85，江苏金坛市医疗器械厂）；恒温生化培养箱（LRH-250；上海一恒科技有限公司）；显微镜（BME，徕卡显微系统上海贸易有限公司）；高压灭菌锅（MLS-3750，SANYO）；电子数显游标卡尺（LINKS，II型，0～150 mm）；火焰光度计；分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 可培养细菌的分离纯化称取植物根际土壤5 g，置于无菌水95 mL中，于180 r/min、28℃下摇匀30 min，将土壤悬液按梯度进行稀释后，分别取10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液各100μL，采用稀释涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培养基中，倒置于28℃恒温培养箱，培养24 h。挑取细菌单菌落，经3次划线纯化获得纯培养，接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，培养24 h，作为菌种置于4℃冷藏箱中备用。

1.2.2 耐盐根际促生菌的分离筛选用牛肉膏蛋白胨培养基于28℃活化菌株24 h，转接至阿须贝培养基上，于28°C培养。定期观察菌株生长情况，以“+”代表菌株在平板上长出菌落，以示其具有固氮能力。从划线第2天开始，如果长出菌落记为“+++++”，每延迟1天长出菌落减少1个“+”，连续观察至第7天，未生长的菌株记为“-”。

将活化后的菌株点接于CAS平板上，每板3个点，每株菌设3个重复，于28℃培养48 h，观察并记录有无橙色晕圈，测量单菌落橙色晕圈直径（D）和菌落直径（d），每个晕圈和菌落直径各测量3次取平均值，计算D/d比值。D/d比值小于1记“+”；D/d比值大于1且小于1.5记“++”；D/d比值大于1.5记“+++”。“+”越多代表菌株具有越强的产铁载体能力，而菌株周围未产生橙色晕圈的菌株，即不产铁载体，记为“-”。

菌株的解磷量采用钼锑抗比色法[19]、解钾量采用火焰光度法[20]、IAA产量采用Salkowski比色法[21]、ACC脱氨酶活性采用α-酮丁酸法[22]测定。

在牛肉膏蛋白胨培养基中添加NaCl使其质量分数达到5%，6%，7%，8%，9%，共设5个梯度，制成盐平板。将活化后的菌株依次点接到不同质量分数盐平板上，每株菌设置3个平板重复，于28℃培养24 h。用游标卡尺测量菌落直径。每个菌落直径测量3次，取平均值。菌株能生长的最高盐分质量分数为该菌株的NaCl耐受值。同理，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液调节牛肉膏蛋白胨培养基pH值，设pH=6、7、8、9、10共5个梯度，制成酸碱度平板，依次点接供试菌株到不同pH值的酸碱度平板上，每株菌设3个重复，于28℃培养24 h后测量菌落直径。菌株能生长的最高pH值为该菌株的pH耐受值。

1.2.3 数据处理和分析采用Microsoft Excel 2016进行数据处理和图表制作，采用SPSS 21.0数据处理软件进行方差分析，采用LSD法在P＜0.05水平上检测差异性。DNA序列同源性比较使用NCBI系统（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），进化树的构建采用Mega-X软件。

1.2.4 耐盐促生菌的分类鉴定参考《常见细菌系统鉴定手册》[23]，对目标菌株开展形态学鉴定和生理生化鉴定。活化菌株，提取基因组DNA，对细菌的16 SrRNA基因进行PCR扩增、电泳和回收[24]，委托北京奥维森基因科技公司完成测序。将得到的测序结果提交至Genbank获得序列号，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，依据对比信息对菌株进行分析鉴定。在数据库中选择相近种属的基因序列，使用Mega-X软件构建系统进化树，初步确定菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 菌株的促生活性

共分离获得细菌83株，其中具有固氮作用的菌株有23株，具有解磷作用的菌株19株，具有解钾作用的菌株14株，具有产IAA能力的菌株15株，具有产铁载体能力的菌株11株，具有ACC脱氨酶活性的菌株10株。其中菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5具有2种以上的促生功能，且促生活性较强，如表1所示。经过比较可知，菌株PJ10具有较强的解磷活性，无机磷解磷量为（44.10±0.12）mg/L；菌株PL11和HJ9具有较强的解钾能力，解钾量分别为（10.33±0.08）mg/L和（11.01±0.03）mg/L；菌株PL11和HY5具有较强的产IAA能力，分别为（34.01±0.01）mg/L和（32.41±0.08）mg/L；菌株HL3具有较强的固氮能力，但不具有解钾和产生IAA的能力。

表1 细菌的促生活性

2.2 菌株的盐碱耐受性

对菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5进行盐碱耐受性检测，结果见图1。在pH=7时，各菌落直径最大，菌落生长良好。当培养基pH值超过7，各菌落的直径均呈降低趋势，但不同菌株的表现存在差异。与pH=7中的菌落直径比较，pH=8时，HJ9菌落直径降低了39.55%，其生长能力大幅下降；pH=9时，PL11和HL3的菌落直径分别下降了8.73%和9.43%，而PJ10和HY5的菌落直径仅降低了4.24%和4.32%；pH=10时，HJ9不能生长，HL3生长能力下降了54.45%；pH=11时，PJ10、HY5仍具有较好的生长能力，PL11则下降了56.67%。

图1 不同p H值对菌株生长的影响

由图2可知，在w（NaCl）=5.00%时，各菌落直径最大，与其直径相比，当w（NaCl）=6.00%时，PL11菌落直径下降了35.58%；w（NaCl）=8.00%时，PL11不能生长，HL3和HJ9的生长能力分别降低了24.02%和36.02%；w（NaCl）=9.00%时，HL3和HJ9的生长能力继续下降，较w（NaCl）=5.00%时降低了75.55%和55.94%，而HY5和PJ10仅下降了10.10%和11.92%。由此可知，菌株PJ10、HY5、HL3在盐胁迫和碱胁迫条件下均表现出较好的耐受能力，被确认为目标菌株。

图2 不同NaCl质量分数对菌株生长的影响

2.3 菌株的分类鉴定

2.3.1 形态学鉴定将菌株PJ10、HL3和HY5于28℃培养24 h，观察菌落及菌体形态，其特征如图3所示。

图3 目标菌株的形态特征

PJ10菌株的菌落较大，呈白色，表面光滑干燥，边缘整齐，培养基颜色无变化；菌体杆状，（0.4～0.5）×（0.9～1.0）μm，有芽孢。

HL3菌株的菌落较大，呈白色，表面光滑湿润，边缘整齐，培养基颜色无明显变化；菌体短杆状，（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm，有芽孢。

HY5菌株的菌落较大，呈白色，表面光滑干燥，边缘整齐，培养基颜色无变化；菌体杆状，（0.3～0.4）×（0.7～0.8）μm，有芽孢。

初步判断3个菌株均为芽孢杆菌属细菌。

2.3.2 生理生化鉴定由表2可知，3个菌株的生理生化检测结果符合芽孢杆菌属细菌的鉴定特征。

表2 目标菌株的生理生化特性

2.3.3 分子生物学鉴定将3株目标菌的基因测序结果录入NCBI，获得Genbank编号分别为PJ10菌株MW585077、HL3菌 株 MW585078、HY5菌 株MW585079。各菌株基因序列经BLAST比较并构建系统进化树。PJ10菌株与壁芽孢杆菌（B.muralis）（MT598008）位于进化树同一分支，相似性为100%，见图4。HL3菌株与短小芽孢杆菌（B.pumilus）264-LRN9（MF007158）位于进化树同一分支，同源性98.66%，见图5。HY5菌株与萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）JCM9070（NR_024689）相似性为100%，见图6。

图4 菌株PJ10系统发育树

图5 菌株HL3系统发育树

图6 菌株HY5系统发育树

3 讨论与结论

芽孢杆菌分布广泛，对盐碱、高温等胁迫条件具有一定抵抗能力，常被作为菌种筛选目标[25]。从南通市沿海滩涂盐碱地中筛选得到的巨大芽孢杆菌（B.megaterium）B7，具有产IAA能力、固氮能力、解磷能力和ACC脱氨酶活性，在w（NaCl）=6%的条件下可正常生长[26]。枯草芽孢杆菌（B.subtilis）JC01具有溶磷和产铁载体能力[27]。单纯芽孢杆菌（B.simplex）SD5具有固氮和解磷作用[28]，但是2株菌的耐盐碱能力不明。马氏芽孢杆菌（B.marmarensis）在pH=12、（NaCl）=20%的条件下可正常生长，其在盆栽实验中表现出较好的促生作用[29]。壁芽孢杆菌HS4具有产IAA能力，耐盐碱能力不明[30]。短小芽孢杆菌JPVS11具有产IAA能力和ACC脱氨酶活性，且在w（NaCl）=9%的条件下能正常生长[31]。萎缩芽孢杆菌GQJK17S8具有溶磷能力，且在w（NaCl）=10%的条件下能正常生长[32]。这说明芽孢杆菌属中许多菌株具有促生能力，兼具耐盐碱能力，是PGPR菌种的重要来源。

芽孢杆菌的耐盐碱性主要依靠其耐盐碱基因的表达。如枯草芽孢杆菌的基因组有编码逆向转运蛋白的基因mrp。这些逆向转运蛋白可使微生物在极端盐碱环境中维持菌体盐离子平衡和酸碱度稳态，使微生物具备抗盐碱胁迫的能力[33—34]。蜡样芽孢杆菌（B.cereus）的全基因组测序结果显示，49个基因可能与其耐盐碱性相关[35]。说明芽孢杆菌耐盐碱菌株的相关基因资源丰富，对其深入认识有助于盐碱地的科学利用和抗盐碱性植物的基因工程育种。

本研究从3种典型盐生植物的根际土壤中筛选获得3株PGPR，分别为壁芽孢杆菌PJ10、短小芽孢杆菌HL3和萎缩芽孢杆菌HY5，其分别具有一定的固氮、解磷、解钾、产IAA、产铁载体能力和ACC脱氨酶活性，在耐盐碱性方面表现良好，具有进一步开发利用的价值。

多株PGPR复配的复合型菌剂较单一菌种菌剂对植物的促生效果更强[36—37]。因此，有待对以上3株耐盐碱PGPR开展复配研究，以明确其最佳复配组合，为新型微生物肥料的开发和利用提供技术支持。