基于网络药理学探讨清痰化瘀方治疗冠心病痰热瘀结证的作用机制

杨志华，毕颖斐，毛静远，王贤良，李金哲，任晓宇

冠心病是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或闭塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病[1-2]。中医学将冠心病归属于“胸痹”“心悸”“水肿”“喘证”等范畴[3]。随着人们生活方式和饮食结构的改变，血瘀、痰浊等冠心病标实证素较前明显增多，且常郁而化热，痰热瘀结已成为冠心病较常见的中医证候表现[4]。清痰化瘀方为天津中医药大学第一附属医院毛静远教授临床治疗冠心病痰热瘀结证的经验方剂，主要由半夏、瓜蒌(皮)、茯苓、陈皮、丹参、黄连、枳壳组成，方中陈皮、半夏、茯苓是二陈汤的核心药物组成，具有燥湿化痰、理气和中的功效，黄连、半夏、瓜蒌(皮)是小陷胸汤的药物组成，具有清热化痰、宽胸散结的功效，丹参活血化瘀、通经止痛，枳壳理气宽中，全方共奏清热化痰、活血化瘀、理气宽胸的功效。临床实践提示，清痰化瘀方可有效缓解冠心病痰热瘀结证病人临床症状，提高运动耐量和生活质量。由于中药及其复方具有多成分特点，这种复杂性使其作用机制难以明确。网络药理学是将药物作用网络与生物网络整合在一起，分析药物在此网络中与特定节点或模块的相互作用关系，从而理解药物和机体相互作用的科学[5]，从整体观角度认识药物与疾病间的相互作用[6]。本研究运用网络药理学方法对清痰化瘀方治疗冠心病的化学成分、作用靶点、生物学过程、信号通路等方面进行分析，旨在揭示清痰化瘀方治疗冠心病痰热瘀结证可能的作用机制，为其临床合理应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 清痰化瘀方化学成分的筛选 运用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，筛选清痰化瘀方中陈皮、半夏、茯苓、黄连、丹参、瓜蒌(皮)、枳壳的活性成分。药物在人体内要经过吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程才能到达靶器官发挥其治疗作用，基于口服生物利用度(orlbioavailability，OB)、类药性(drug-likeness，DL)是筛选药物的关键参数，以ADME参数中的OB≥30%、DL≥0.18[7-8]为限制条件进行初步筛选，汇总结果，去除重复、删除没有相关信息的化学成分，即为清痰化瘀方治疗冠心病相关的化学成分。

1.2 清痰化瘀方潜在靶点的收集及网络构建 根据已筛选的清痰化瘀方中药的化学成分，通过TCMSP平台检索与化学成分相关的潜在靶点，并通过Uniprot数据库将预测出的靶点名转换为基因名。将筛选的潜在靶点导入Cytoscape 3.5.1软件，构建“中药-化学成分-靶点”网络图。

1.3 冠心病相关靶点的筛选 以coronary heart disease为关键词，利用DrugBank、治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)、DisGeNET、美国国家生物技术信息中心(Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库，筛选与冠心病相关的基因，删除重复基因，共收集到1 104个与冠心病相关的靶点基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络构建 将冠心病靶点与清痰化瘀方靶点进行Venn分析，筛选出二者共同靶点，将共同靶点导入String数据库，构建PPI网络模型，将物种设置为“Homo sapiens”，为确保数据的可靠性，蛋白最低相互作用阈值设为“highest confidence”(>0.9)，对蛋白相互作用进行筛选，并将结果导入Cytoscape软件，分析PPI网络并对网络进行渲染。在网络中，1个节点的度(degree)表示在PPI网络中与该节点直接相互作用的节点的数目，节点越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强。设置节点大小和颜色深度反映度的大小，节点越大、颜色越深，说明节点的自由度越大。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 采用DAVID(Version 6.8，http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)在线分析数据工具对共同靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。以错误风险率(FDR)<0.01及P<0.01为筛选条件，取P值最小的前20个生物学过程；以P<0.01为筛选条件，筛选富集最显著的前20条信号通路，并将通路上的靶点基因以及涉及的化合物、中药导入Cytoscape 3.5.1软件，构建“中药-化合物-靶点-疾病”网络，阐明清痰化瘀方治疗冠心病的作用机制。其中的节点代表化合物、靶点或疾病，边代表这些节点之间的相互关系，即某个化学成分与靶点或靶点与疾病之间的联系。

2 结 果

2.1 清痰化瘀方的化学成分 本研究从TCMSP数据库筛选清痰化瘀方的化学成分，以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，筛选结果：陈皮5个、半夏13个、茯苓15个、黄连14个、丹参65个、瓜蒌(皮)11个、枳壳5个，删除重复成分4个，剔除没有相关信息成分23个，共有101个化学成分。部分化学成分信息详见表1。

表1 清痰化瘀方部分化学成分基本信息

(续表)

2.2 清痰化瘀方“中药-化学成分-靶点”网络构建 通过 Cytoscape 软件中 network analyzer 插件进行拓扑分析，得到清痰化瘀方“中药-化学成分-靶点”网络图(见图1)。图中共包括361节点，其中，7个中药节点，101个化学成分节点，253个靶点节点和1 501条边。红色三角形代表7味中药的节点，绿色矩形代表靶点节点，樱桃红、淡红色、绿色、黄色、蓝色、深蓝色、浅绿色菱形分别代表枳壳、陈皮、茯苓、半夏、丹参、瓜蒌(皮)、黄连的化学成分节点，MOL004328和MOL005828是陈皮、枳壳两味中药的化学成分，MOL000358、MOL002776分别是半夏和枳壳、半夏和丹参共有的化学成分。分子MOL000098(quercetin)有 141个潜在靶标，其次是MOL007154(tanshinone ⅡA)有39个靶标，MOL000358(beta-sitosterol)有37个靶标、MOL000006(luteolin)有 36个潜在靶标，MOL002174(baicalein)有34个。这些度值较高的药物分子有可能在清痰化瘀方的药理功能中发挥相对重要的作用。在253个靶点节点中有142个靶标至少与2个化合物连接，网络中绝大多数候选化合物与 2 个蛋白质靶点连接，也说明清痰化瘀方中含有的候选化合物分子可能作用于整个生物网络系统，体现了清痰化瘀方多成分与多靶点之间共同作用的机制，同时也符合中药复方的特点。

图1 清痰化瘀方中药-化学成分-靶点网络图

2.3 共同靶点PPI网络构建 将1 104个冠心病靶点与254个药物靶点输入Venny 2.1软件得到112个共同靶点。将112个共同靶点导入String数据库进行PPI分析，去除无相互作用的靶点，将结果导入Cytoscape 3.5.1软件进行拓扑结构分析。该网络由96个节点、300条边组成，平均节点长度为6.25，其中，节点的大小由自由度决定，自由度越大，节点越大，节点颜色越深。详见图2。

图2 共同靶点PPI网络

2.4 “中药-化学成分-共同靶点-疾病”网络构建 运用 Cytoscape 软件构建清痰化瘀方中药-化学成分-共同靶点-疾病网络图(见图3)，图中共216个节点，其中7味中药(红色节点)，96种化学成分(蓝色节点)，112个共同靶点(绿色节点)，1种疾病(黄色节点)。结果显示，槲皮素(quercetin)、丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、川陈皮素(nobiletin)、巴马汀(palmatine)、4-甲亚基丹参新酮(4-methylene miltirone)、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮(2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione)、黄连素(berberine)等化学成分度值排名靠前，在整个网络中发挥重要作用，可能是清痰化瘀方治疗冠心病的关键化学成分。

图3 “中药-化合成分-共同靶点- 疾病”网络图

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组分(cellular component，CC)3 个分支。对共同靶点进行GO功能富集分析，得到640个GO功能富集条目，以FDR<0.01及P<0.01为筛选条件，前20个生物学过程见表2。结果显示，有13个条目与生物过程有关，主要涉及细胞老化、低氧反应、药物反应、NO生物合成过程正调控、炎症反应、正调控平滑肌细胞增殖，正调控RNA 聚合酶Ⅱ启动子等过程；有3个条目与细胞组成有关，涉及细胞内外间隙等过程；有4个条目与分子功能有关，涉及酶结合、类固醇激素受体活性、细胞因子活性等过程。

表2 GO功能富集分析结果

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID对112个共同靶点进行KEGG通路富集分析，共得到108条信号通路，以P<0.01为筛选条件，选取清痰化瘀方治疗冠心病相关的前20条信号通路，见表3。并通过ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)对富集分析结果进行可视化处理(见图 4)。其中，X 轴表示富集因子(rich factor，即背景基因集中这个通路所有基因的数量)，Y 轴代表通路，气泡大小代表目标基因在这个通路的基因数量，气泡颜色代表富集显著性，即P值的大小。

表3 20条信号通路富集分析结果

(续表)

图4 KEGG 通路富集结果气泡图

3 讨 论

本研究运用网络药理学方法筛选出清痰化瘀方中药的101个有效成分，同时通过构建“中药-化学成分-作用靶点”网络，分析了中药、化合物、作用靶点之间的相互关系，揭示了清痰化瘀方多成分-多靶点治疗机制。本研究发现槲皮素、丹参酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陈皮素、巴马汀、4-甲亚基丹参新酮、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黄连素等化学成分在整个网络中度值较高，可能是清痰化瘀方治疗冠心病的关键化学成分。现代药理研究表明，丹参具有保护心肌、抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、改善微循环、抗凝血及抗血小板聚集、调血脂、降血压、免疫调节等作用[9]，丹参酮ⅡA和木犀草素是丹参的活性成分，丹参酮ⅡA具有保护心肌细胞、抗凝血、抗血小板聚集、降低高脂血症大鼠肝脏中的脂质沉积的作用[10-12]；木犀草素可以减轻心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡损害，其机制可能与减少促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α 及白介素-6(IL-6)的产生，进而减轻炎症反应有关[13]。黄连具有抗炎、降血糖、抗肿瘤、调血脂、抗心律失常等药理活性[14]，黄连的活性成分槲皮素可通过抗炎、抗氧化、降低血清三酰甘油和总胆固醇以及抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化等作用，降低冠心病的发病风险[15]。半夏和枳壳活性成分中均含有β-谷甾醇，研究表明β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集、抗动脉硬化、防治冠心病和高血压等作用[16-17]。柚皮素、川陈皮素均是陈皮、枳壳的化学成分，柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化、清除自由基的作用[18-20]，对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护心肌的机制可能与减轻氧化应激损伤和抑制炎症反应有关[21]，川陈皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等药理作用[22]。

GO富集分析结果显示，清痰化瘀方治疗冠心病主要涉及细胞增殖与凋亡、炎症反应、氧化应激、激素分泌、NO合成、物质代谢等生物学过程；有酶、蛋白、细胞因子、受体、转录因子、激素等多种物质参与，提示清痰化瘀方治疗冠心病是一个十分复杂的生物学过程。通过对112个靶蛋白进行PPI分析发现，TNF、蛋白激酶1(AKT1)、IL-6、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、MAPK8、血管内皮生长因子 A(VEGFA)、原癌基因蛋白(FOS)等靶蛋白度值较大，说明这些靶蛋白在此网络图中发挥关键作用，可能是清痰化瘀方治疗冠心病的关键靶蛋白。例如，TNF-α和IL-6等细胞因子参与机体炎症反应，并且作为冠心病的独立危险因素，其表达水平升高可增加心血管疾病的患病风险[23]，血液中TNF-α、IL-6的含量增高可以增加冠心病或者非致死性心肌梗死病人的死亡率[24]。

KEGG通路富集结果显示，清痰化瘀方治疗冠心病的较多靶点被富集在TNF、低氧诱导因子-1(HIF-1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、Toll样受体、环磷酸鸟苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)等信号通路上。HIF-1信号通路与炎症反应关系密切[25]，当机体缺血缺氧时，HIF-1不仅可以促进糖酵解，加强无氧代谢途径，使细胞在缺氧条件下获得足够的能量，维持细胞生存[26]，而且能够促进炎症中新血管生成[27]；此外，HIF-1可与缺血、缺氧下高表达的 P53 结合，增加其稳定性，而 P53 是缺氧条件下诱导炎症细胞凋亡的重要参与因子，加快炎症细胞凋亡的发生[28]；HIF-1 还可诱导促红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等促红细胞生成因子的表达，加快氧的运输，提高氧的利用能力[29]，心肌细胞缺血缺氧时，可以通过调控HIF-1信号通路，促进血管新生，增加心肌血供，对保护心肌具有重要意义[30]。现有的研究结果证明，cGMP-PKG信号通路对于调控心血管系统的正常功能起着重要的作用，在调节血压、抑制动脉粥样硬化和抗再狭窄、抗血管损伤、调节血管平滑肌细胞的收缩和舒张、抑制心肌细胞肥大等方面发挥重要作用[31-32]。PKG通路激活能够通过引起血管舒张、抑制内皮细胞通透性以及对心肌细胞的负性肌力作用而保护心血管系统[33]。PI3K-Akt 信号通路在冠心病的发生发展过程中发挥着重要作用，研究发现PI3K-Akt 信号通路可通过调节血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞凋亡等影响动脉粥样硬化病变的发生发展[34]。韩军等[35]发现金丝桃苷激活可通过激活PI3K-Akt 信号通路，改善心室肌收缩与舒张功能，清除氧自由基，减少心肌酶释放，减轻炎症反应，上调 Bcl-2 蛋白表达，下调 Bax 蛋白表达，抑制细胞凋亡对大鼠心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。

本研究运用网络药理学方法，对清痰化瘀方治疗冠心病的化学成分、关键靶点、生物过程及通路进行了初步探讨。结果显示，清痰化瘀方中的槲皮素、丹参酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陈皮素、巴马汀、4-甲亚基丹参新酮、2-异丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黄连素等有效化学成分，可能通过作用于TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、MAPK8、VEGFA、FOS等关键靶点，调节PI3K-Akt、cGMP-PKG、TNF、HIF-1、Toll样受体等多条信号通路治疗冠心病。但本研究仅基于系统数据进行初步分析，存在一定的局限性，清痰化瘀方治疗冠心病的具体作用机制仍需要开展实验进一步验证。