前足跗节及触角在小菜蛾雌蛾对芥子油苷刺激产卵反应中的作用

侯雯,苗春丽,董双林

(南京农业大学植物保护学院,江苏 南京 210095)

小菜蛾(Plutellaxylostella)为世界性重要农业害虫,专一取食甘蓝、油菜、萝卜等十字花科蔬菜和油料作物,每年造成全球40～50亿美元的经济损失[1]。在我国,小菜蛾普遍发生,尤以长江流域及以南地区严重,每年造成经济损失和防治费用达7.7亿美元[2]。芥子油苷(glucosinolate,GS)是十字花科植物的特征性次生防御物质,当植物组织被昆虫取食后,黑芥子酶和芥子油苷充分接触并发生水解反应,迅速并大量生成异硫氰酸酯(isothiocyanate,ITC)等有毒物质而对害虫发生毒害。小菜蛾之所以能专一性取食十字花科植物而不被GS毒害,是因为其幼虫消化道内存在一种特殊的硫酸酯酶,可在食物被摄入后很快将GS脱硫,形成既无毒性又不能被黑芥子酶降解的脱硫GS[3-4]。更有趣的是,小菜蛾分别以GS及ITC为重要嗅觉和味觉信号来定位和识别寄主植物并进行产卵或取食[5-7]。Liu等[8]发现嗅觉受体OR35和OR49共同参与小菜蛾对ITC气味的特异性感受,但有关小菜蛾感受GS的味觉分子机制尚不明确。

昆虫的味觉感器主要分布于触角、口器附肢、足跗节和产卵器等组织[9-10]。小菜蛾雌蛾在植物叶片产卵时,常伴有以前足和触角碰触叶片的行为[11-13],因此推测前足跗节和触角可能参与了对叶面芥子油苷等信号化合物的感受。前人研究发现,去除触角使小菜蛾雌蛾在不同介质间的产卵选择性及雄蛾的交配率降低[14],去除触角和足跗节使小菜蛾雌蛾对薄荷等5种非寄主植物乙醇提取物的产卵忌避反应降低[15]。为了明确在小菜蛾对芥子油苷介导的产卵刺激反应中触角和前足跗节的作用,本研究首先利用不同浓度芥子油苷粗提液测定并证实了芥子油苷对小菜蛾雌蛾产卵的刺激作用,然后利用2种产卵介质(保鲜膜和植物叶片),通过去除前足跗节或/和触角后的雌蛾产卵选择性试验,研究前足跗节和触角在芥子油苷刺激产卵中的作用。研究结果为进一步研究小菜蛾对芥子油苷的感受机制提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 昆虫饲养及处理

小菜蛾幼虫以人工饲料[16]饲养,成虫用10%(体积分数)蜂蜜水饲养,养虫室温度为(27±1)℃,湿度为(65±5)%,光周期(光/暗时间)为15 h/9 h。

选择2日龄雌、雄成虫进行产卵选择性试验。酸蚀前足跗节和去除触角采用Yan等[14]和Zhang等[17]的方法。共设3个处理:1)酸蚀前足跗节(CP):用二氧化碳麻醉试虫10 s,然后用棉签蘸取5 mol·L-1盐酸溶液,在体视镜下接触试虫2个前足跗节各50 s;2)去除触角(CA):用二氧化碳麻醉试虫10 s,然后在体视镜下剪去2个触角;3)去除触角+酸蚀前足跗节(CA+CP)。对照试虫在麻醉后用水涂抹前足跗节。

1.2 供试植物

萝卜(Raphanussativus)和豌豆(Pisumsativum)种子购自汕头市澄海区金沙蔬菜研究所,种植温度为(22±1)℃,湿度为(65±5)%,光周期为16 h/8 h。

1.3 芥子油苷粗提液制备

参考何洪巨等[18]的方法制备芥子油苷粗提液。称取3 g萝卜种子,在105 ℃下烘干1 h使黑芥子酶失活,然后用液氮研磨成粉。将粉末加到45 mL煮沸的甲醇(100%)中,80 ℃恒温水浴15 min。提取液通过0.28 μm滤膜过滤,残留物经40 mL甲醇水溶液(80%)再次提取10 min,再通过0.28 μm滤膜过滤。将2次滤液混合,加入4 mL 0.4 mol·L-1醋酸钡(以去除蛋白质),反应2 min后,7 000 r·min-1离心10 min,上清液经0.22 μm滤膜过滤后浓缩至40 mL,所得即为芥子油苷粗提液。

1.4 不同含量芥子油苷粗提液对小菜蛾产卵选择的影响

取芥子油苷粗提液,用甲醇配成含量分别为5%、1%、0.1%和0.01%的溶液。将2个培养皿(直径 9 cm)用封口膜覆盖后,在膜上涂抹500 μL芥子油苷粗提液(处理)或甲醇溶液(对照),对角放置于产卵笼(35 cm×24 cm×20 cm)[11]中,笼中间放置10%蜂蜜水(图1)。在光期向笼内放入20对2日龄小菜蛾成虫,24 h后记录培养皿封口膜上的卵量。产卵选择指数=(处理封口膜上卵量-对照卵量)/(处理封口膜上卵量+对照卵量)。每个芥子油苷粗提液浓度重复4次(笼)。

图1 小菜蛾对芥子油苷粗提液的产卵刺激反应测定示意图Fig.1 Determination of oviposition response of Plutella xylostella to crude extract of glucosinolates

1.5 酸蚀前足跗节或去除触角对小菜蛾向芥子油苷产卵选择性的影响

分别以封口膜和植物叶片为产卵介质进行测定。以封口膜为产卵介质的测定同1.4节的试验方法。在产卵笼内对角放置的2个培养皿,分别在其封口膜上涂抹500 μL 1%芥子油苷粗提液和500 μL甲醇溶液(100%);向笼内接入20对2日龄雌、雄小菜蛾,其中雌蛾设3个处理:酸蚀前足跗节(CP)、去除触角(CA)、去除触角+酸蚀前足跗节(CA+CP),以不进行组织去除处理的雌蛾为对照。分别测定不同处理雌蛾的产卵选择性并与对照雌蛾进行比较。每个小菜蛾雌蛾处理重复测定8或15次(笼),CA+CP为15次重复,其他处理为8次重复。

以植物叶片为产卵介质的测定方法同上,只是产卵介质改为新鲜的植物叶碟。产卵笼内四角共放置4个培养皿,其中2个皿内放置十字花科植物萝卜的叶碟(直径1 cm),另2个放置非十字花科植物豌豆的叶碟;皿内底部垫有湿润滤纸以保湿叶片;同种植物叶碟的培养皿在笼内对角放置。分别测定不同处理雌蛾的产卵选择性并与对照雌蛾进行比较。每个雌蛾处理重复7次(笼)。

1.6 数据处理与分析

采用SPSS 35.0软件利用单因素方差分析(One-way ANOVA)法分析小菜蛾在不同处理产卵选择指数间的差异,用Tukey HSD 测验法比较处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 芥子油苷对小菜蛾雌蛾产卵的刺激作用

分别用5%、1%、0.1%和0.01%芥子油苷粗提液测试小菜蛾雌蛾产卵偏好性。结果表明,不同含量的芥子油苷粗提液均能引起小菜蛾的产卵选择偏好,并具有明显的剂量效应,选择偏好性随着粗提液含量的增加而显著增强(图2)。说明芥子油苷粗提液对小菜蛾雌蛾产卵具有显著的刺激作用。

图2 芥子油苷粗提液对小菜蛾产卵选择指数(A)和产卵量(B)的影响Fig.2 Effect of glucosinolate crude extract on oviposition preference index(A)and deposited eggs(B) on glucosinolates-treated and control parafilms by Plutella xylostella 不同小写字母表示不同处理间差异显著。 Different lowercase letters indicate significant difference among treatments.*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001。下同 The same as follows.

2.2 酸蚀前足跗节和去除触角的小菜蛾对芥子油苷粗提液的产卵选择性

与对照雌蛾(CK)相比,去除触角+酸蚀前足跗节(CA+CP)、酸蚀前足跗节(CP)和去除触角(CA)处理雌蛾对芥子油苷粗提液的产卵选择指数分别降低97%、36%和22%(图3-A),同时在2种介质上的产卵总量显著减少,幅度分别为84%、44%和72%(图3-B)。其中,CA+CP处理雌蛾对芥子油苷的选择性几乎丧失,说明芥子油苷主要由前足跗节和触角来感受。

图3 酸蚀前足跗节及去除触角后芥子油苷粗提液对小菜蛾产卵选择性(A)和产卵量(B)的影响Fig.3 Effects of acid ablation of foreleg tarsus or/and removal of antennae on oviposition preference index(A)to glucosinolate crud extract and deposited eggs(B)on glucosinolates-treated and control parafilms by Plutella xylostella CK:对照Control;CA:去除触角Removal of antennae;CP:酸蚀前足跗节Acid ablation of foreleg tarsus;CA+CP:去除触角和酸蚀前足跗节Removal of antennae and acid ablation of foreleg tarsus. 下同The same as follows.

2.3 酸蚀前足跗节或/和去除触角对小菜蛾寄主植物产卵选择性的影响

从图4可知:对照组小菜蛾(CK)对萝卜叶片有强烈的产卵偏好(选择指数为0.94),而去除触角+酸蚀前足跗节(CA+CP)、酸蚀前足跗节(CP)和去除触角(CA)的小菜蛾,对萝卜叶片的产卵偏好均显著降低,和对照相比其选择指数分别降低55%、15%和23%(图4-A);3个处理小菜蛾在2种叶片上的产卵总量分别较对照降低79%、45%和76%(图4-B)。制作萝卜叶碟时造成的叶片损伤可能导致少量芥子油苷的降解并释放出ITC物质,因此,所得产卵选择性可能还包含部分ITC的作用。

图4 酸蚀前足跗节及去除触角后萝卜和豌豆叶片对小菜蛾产卵选择指数(A)和产卵量(B)的影响Fig.4 Effects of acid ablation of foreleg tarsus or/and removal of antennae on oviposition preference index(A) to Raphanus sativus leaf disc and deposited eggs(B)on Raphanus sativus and Pisum sativum leaf discs by Plutella xylostella

3 讨论

芥子油苷是十字花科植物的特征次生代谢物质,在对昆虫取食及病原微生物侵染的化学防御中起重要作用。经过长期的适应性进化,小菜蛾等十字花科植物专食性昆虫不但克服了芥子油苷的毒性,而且雌成虫还将芥子油苷及其挥发性降解产物ITC等作为重要的化学信号,帮助其对寄主植物的定向识别并产卵。在自然条件下,小菜蛾雌蛾主要通过ITC等嗅觉信号来寻找十字花科寄主植物[8],而当降落到植物后则通过对芥子油苷的感受进行寄主识别并产卵[7]。本研究证实了芥子油苷对小菜蛾雌蛾产卵的刺激作用,同时表明芥子油苷主要由触角和前足跗节来感受,去除这2个器官后芥子油苷的刺激作用显著降低。研究结果为进一步解析小菜蛾识别寄主植物的化感分子机制奠定了基础。

本研究中,利用芥子油苷粗提液进行的产卵选择性试验表明,不同含量的粗提液均可吸引小菜蛾产卵,且吸引作用随芥子油苷含量的增加而增强,具有明显的剂量效应;进一步以植物叶片进行的试验也表明,小菜蛾更喜欢在萝卜(十字花科植物)叶片而不是豌豆(非十字花科植物)叶片上产卵。本研究证实了芥子油苷对小菜蛾产卵的刺激作用,与前人的结果一致[19-20]。Reed等[19]用芥菜(十字花科植物)提取物进行试验,发现加有提取物的容器之中小菜蛾的产卵量更多,且在一定范围内产卵量与浓度成正比;喻国泉等[20]将不同浓度芥子油苷喷在非十字花科植物通菜上进行产卵选择测定,发现小菜蛾在通菜上的着卵量与所喷的芥子油苷粗提液的浓度呈正相关。芥子油苷在植物组织遭到机械损伤后会与黑芥子酶接触并发生水解反应,形成ITC、硫氰酸酯、腈类或环硫腈、唑烷-2-硫酮等化合物[21],其中挥发性的ITC可以吸引小菜蛾雌蛾产卵[6,8]。由于黑芥子酶在100 ℃以上失活[22],因此我们在提取芥子油苷粗提液前,将萝卜种子在105 ℃高温处理1 h,避免了ITC的产生,所得结果排除了ITC的影响。

小菜蛾雌蛾在产卵时常伴有以前足和触角碰触叶片的行为[11-13],因此推测前足跗节和触角可能参与了其对叶片上芥子油苷等信号化合物的感受。本研究发现,前足跗节和触角分别缺失后,小菜蛾雌蛾对十字花科植物萝卜叶片的产卵偏好均显著降低,说明前足跗节和触角上均存在芥子油苷敏感的味觉感器。味觉感器主要为锥形感器、栓锥感器、毛形感器、刺形感器、板形感器等[23]。小菜蛾雌蛾触角存在毛形感器、刺形感器和栓锥感器等8种感器[24]。魏辉等[15]利用扫描电镜观察发现,小菜蛾前足跗节存在毛形感器、刺形感器和具弯端感器。此外,小菜蛾触角和前足分别表达16和19个味觉受体(gustatory receptor,GR)基因[11]。在小菜蛾的触角和前足跗节上,哪些感器及GR负责对芥子油苷的感受,有待进一步研究。

本研究利用植物叶碟和封口膜2种产卵介质的测试结果表明,触角和前足跗节在芥子油苷引起的产卵选择性中的作用大致相当。当触角和跗节均去除后,2种产卵介质所得结果有较大差异:叶碟法中雌蛾对萝卜叶的产卵偏好性虽有显著降低,但选择指数仍近0.4;而封口膜涂抹芥子油苷粗提液的测定中,雌蛾对芥子油苷的产卵偏好性基本丧失。其主要原因可能是受萝卜叶碟中ITC等吸引产卵或豌豆叶碟中某些驱避产卵气味的影响。在自然状态下,植物叶片会释放多种挥发物;制备叶碟时造成的机械损伤也会诱导叶片释放新的植物挥发物或使原有挥发物的释放量增加,如萝卜叶片的机械损伤会引起ITC的释放并吸引小菜蛾产卵[6,8]。此外,除触角和足外,在蛾类昆虫对产卵介质选择时,产卵器通常也起到重要作用。Li等[25]发现烟青虫产卵器上的毛形感器可以感受植物挥发物顺-3-己烯丁酸酯,在选择寄主植物产卵中起作用;我们对小菜蛾感受ITC的2个受体基因(OR35和OR49)的组织表达谱分析表明,这2个基因在产卵器中也有表达(未发表资料),也说明产卵器在小菜蛾产卵选择性中起作用。

不同十字花科植物所含芥子油苷的种类及含量不同,同种植物不同组织间通常以种子中的含量较高[26-27],因此本研究以萝卜种子的芥子油苷粗提液进行相关试验。萝卜中含有8种芥子油苷组分,主要有4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基芥子油苷、2-羟基-3-丁烯基芥子油苷和1-甲氧基-3-吲哚甲基芥子油苷[26,28-29]。其中,2-羟基-3-丁烯基芥子油苷和1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷已被证实能刺激小菜蛾产卵[19],其他组分的作用尚不明确,需要进一步研究。