响应面法优化肉苁蓉酒蒸工艺

杲 东

（南京市浦口区中医院药剂科 江苏 南京 211800）

肉苁蓉为《中国药典》收载的中药[1]，其干燥的肉质鳞茎常做中药“大芸”入药，被誉为“沙漠人参”[2-3]。临床上常用黄酒炙肉苁蓉，以增强其补肾壮阳的功效[4]。翻看2020 版《中国药典》，发现对酒炙肉苁蓉的相关描述少之又少，对其酒蒸工艺的介绍更是一带而过。查阅相关文献，刘雯霞[5]采用正交试验研究管花肉苁蓉的酒蒸工艺，但受限于正交试验方法的拘束，其对工艺的研究受限。近年来，随着正交试验的改进方法—响应面法的流行，其本身具有精度高、效率高等特点[6-8]。因此，本文采用响应面法探讨其酒蒸炮制工艺，为肉苁蓉的酒蒸工艺提供指导。

1.材料与仪器

肉苁蓉购买于安徽省亳州市康美中药材市场，产于内蒙古巴彦淖尔盟阿拉善旗，经安徽中医药大学方成武教授鉴定为肉苁蓉的干燥品。本试验开始于2020 年6 月，于2020 年9 月完成。对照品松果菊苷、毛蕊花糖苷（批号分别为82854-37-3、61276-17-3，成都普菲德生物技术有限公司），质量分数≥98%；水为纯净水，黄酒（绍兴市圣御山酒业有限公司），其他试剂均为分析纯。Waters Acquity 液相色谱仪，PDA 检测器。

1.2 方法

1.2.1 含量测定 指标成分松果菊苷、毛蕊花糖苷的测定按照2020 版《中国药典》中的方法进行，HPLC法按照通则0512 准备。

1.2.2 线性关系考察 将松果菊苷和毛蕊花糖苷的对照品混合，分别取1、3、5、7、9 mL 于10 mL 量瓶中，剩余用50%甲醇填满容积。吸取10 μL，按2020 版《中国药典》中的含量测定方法进行测定。横坐标（X）选择质量浓度，纵坐标（Y）为峰面积，得回归方程分别为松果菊苷Y= 125 157X-217 30，r= 0.999 2，毛蕊花糖苷Y= 194 817X-338 61，r= 0.998 3。

1.2.3 方法学考察 （1）精密度考察。精密吸取混合对照品溶液20 μL，重复6 次进样，计算松果菊苷、毛蕊花糖苷的峰面积RSD 值分别为0.42%、0.27%，表明仪器精密度良好。（2）重复性试验。取同一份肉苁蓉样品6 份，测定对应的峰面积。结果松果菊苷、毛蕊花糖苷的质量分数的平均值分别为0.33%、0.61%，RSD 值分别为0.79%、2.27%，表明此方法重复性较好。（3）稳定性试验。吸取肉苁蓉提取液，于0、2、4、8、12、24、48 h 测定松果菊苷、毛蕊花糖苷的峰面积，RSD 分别为0.82%、1.73%。表明48 h 内肉苁蓉的成分稳定。（4）加样回收率试验。取6 份1 g 已知含量的肉苁蓉样品，加入混合对照品溶液（松果菊苷、毛蕊花糖苷分别加2.12、3.52 mg/mL），用50%甲醇补足至50 mL，测得平均回收率分别为98.31%、101.39%，RSD 分别为2.17%、2.22%，加样回收率良好。

1.2.4 样品含量测定 按单因素变量的要求将酒蒸后的肉苁蓉样品分成3 份，按“2.1”项方法测定其对应的峰面积，重复测定3 次，取均值计算含量。

1.2.5 数据标准化处理 为了降低高含量成分对低含量成分造成的掩盖，将测定的成分数据进行Z-score标准化处理[9]，之后将标准化的值相加为综合评分。标准化值=（含量-算术平均数）/标准差。

2.结果

2.1 单因素分析

将标准化处理过后数据的综合评分作为考察指标，考察酒蒸肉苁蓉过程中蒸制时间、料液比、饮片厚度、黄酒度数对其有效成分含量的影响。

2.1.1 蒸制时间对综合评分的影响 根据表1 的条件进行单因素试验设计，每组进行3 次重复测定，采用Z-score 标准化处理数据（表2），取3 次测量的均值作为含量，得出综合评分。当蒸制40 min 时，综合评分达到最大值。当蒸制100 min 时，综合评分为负数。说明，有效成分含量受蒸制时间的影响较大，所以选择40 min为最佳蒸制时间。

表1 单因素分析

表2 单因素结果

2.1.2 料液比对综合评分的影响 根据表1 条件进行单因素试验设计，每组进行3 次重复测定，采用Z-score 标准化处理数据（表2），取3 次测量均值作为含量，得出综合评分。料液比在3 时达到最大值。推测随着料液比的增加，有效成分能更充分地溶解在乙醇中。后续随着料液比的增加，其含量变化不显著。因此，最佳料液比为3。

2.1.3 饮片厚度对综合评分的影响 根据表1 条件进行单因素试验设计，每组进行3 次重复测定，采用Z-score 标准化处理数据表2，取3 次测量的均值作为含量，得出综合评分。4 mm 为酒蒸肉苁蓉最佳的切制厚度。一方面，酒蒸后的肉苁蓉黏性大，切制的厚度较薄，其饮片易黏结成团。切制较厚，不易蒸至透心。因此，选择4 mm 为最佳切片厚度。

2.1.4 黄酒度数对综合评分的影响 根据表1 条件进行单因素试验设计，每组进行3 次重复测定，采用Z-score 标准化处理数据，见表2。取3 次测量均值作为含量，得出综合评分。综合评分随黄酒的度数呈先上升后下降的趋势。当黄酒为12%vol 时，有效成分提取最多。但考虑到乙醇易挥发，难以控制蒸制时相应的变量。因此，不将黄酒度数作为变量进行检测。

2.2 响应面法优化肉苁蓉酒蒸工艺试验

2.2.1 试验设计与结果 响应面法试验设计为：3 个自变量为蒸制时间（A）、料液比（B）、饮片厚度（C），响应值（R）为2 种指标性成分含量的综合评分，见表3。

表3 响应面试验设计

2.2.2 模型显著性分析 按照软件Design-Expert 8.0.6.1 所生成的表格依次输入对应综合评分的值，软件拟合所得二次多项式回归方程，输出的二次多元回归方程为R= 2.36 ＋0.41A-1.29B-0.28C＋0.17AB-0.49AC-0.26BC-1.38A2-2.17B2-1.42C2，决定系数（r2）=0.975 7，调整系数为0.994 4，表明根据输出入的值所拟合得方程较好，试验误差较小，此软件建立的模型可用于松果菊苷和毛蕊花糖苷两种成分含量的综合评分的分析和预测。由表4 的方差分析可知，该模型极显著（P＜0.001），失拟项不显著（P= 0.742 7）。回归方程的显著性表明，一次项A、B，交互项AC，二次项A2、B2、C2有极强的显著性。综上所述，3 个自变量因素对综合评分影响为料液比（B）＞蒸制时间（A）＞饮片厚度（C）。

表4 方差分析效果

2.2.3 肉苁蓉酒蒸最佳工艺参数预测 由图1 可知，响应面的颜色和倾斜度分别反映各因素对响应值的变化趋势和影响程度，响应面曲面图颜色越深，表明其数值的变化趋势越明显，倾斜度越陡峭，表明其单个因素对综合评分的影响越大[10-12]。根据Design-Expert 8.0.6.1软件选择综合评分最大值为3.58 时，最优蒸制工艺参数为蒸制时间58 min，料液比2.51，饮片厚度3.51 mm。

图1 肉苁蓉酒蒸工艺优化响应面图

2.3 验证实验

验证本试验数据可靠性和真实度。为了方便实际炮制工艺的操作，将参数调整为蒸制时间58 min，料液比2.5，饮片厚度3.5 mm，重复3 次，取平均值。结果松果菊苷和毛蕊花糖苷的综合评分为3.47，与预测值3.58相差3.07%，RSD值为1.21 说明肉苁蓉酒蒸工艺的优化参数切实可行，酒蒸工艺可靠，稳定。

3.讨论

在2020 版《中国药典》中，肉苁蓉的酒蒸炮制工艺虽有记载，但具体工艺参数未告知。因此，从中药饮片炮制的规范性和均一性角度考虑，肉苁蓉的酒蒸炮制工艺需得到进一步完善。为了本试验工艺的严谨性，HPLC的各项仪器选用的检测指标均采用药典指标进行试验。黄酒中的乙醇含量随着加热会快速挥发，不利于控制相关变量，因此为了试验的严谨性，将单因素试验中的黄酒度数这一变量删除。

综上所述，试验先对4 个单因素进行筛选，选择最合适的3 个因素，并确定最适当的3 个水平。分别对蒸制时间、料液比、饮片厚度3 个因素进行考察，同时将松果菊苷和毛蕊花糖苷含量进行Z-score 标准化处理后再相加作为综合评分的响应值，通过响应面法得出最佳的工艺参数为蒸制时间58 min，料液比2.51，饮片厚度3.51 mm，并验证了酒蒸炮制工艺的可靠性。肉苁蓉在此酒蒸工艺条件下进行炮制更有利于提高其相应的药效成分，增加补肾壮阳的功效，从而为标准化肉苁蓉炮制工艺提供一些指导。