克氏原螯虾烂尾病病原的分离鉴定及其相关特性分析

刘张淮，吴 霆，王家军，朱春艳，张荧荧，孟庆国

( 1.宝应县水生动物疫病预防控制中心，江苏 扬州 225800； 2.南京师范大学 海洋科学与工程学院，江苏省水生甲壳动物病害重点实验室，江苏 南京 210023 )

克氏原螯虾(Procambarusclarkii)俗称螯虾、龙虾、淡水小龙虾，属甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，主要分布于我国江苏、浙江、安徽、湖北、湖南等十余个省市地区，现已成为我国养殖范围最广的淡水螯虾品种[1]。然而随着我国克氏原螯虾人工养殖业兴起，相关病害的发生也越来越普遍，主要包括真菌性、细菌性、病毒性和寄生虫类疾病。已报道的克氏原螯虾常见病原主要有嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[3-4]、拟态弧菌(V.mimicus)[5]、螺原体(Spiroplasma)[6-7]和白斑综合征病毒[8]等。

克氏原螯虾烂尾病是一种细菌性疾病，在养殖生产中也时有发生，主要病因是由于机械损伤、互相打斗残食或被几丁质分解类细菌感染引起，但病原菌种类未有定论。在烂尾病发病早期，患病虾出现尾扇边缘发红、水泡、溃烂、坏死等症状，高温季节严重感染时可引起病虾整个尾部溃烂甚至死亡。克氏原螯虾细菌性疾病的病原菌种类繁多，其相关研究也十分广泛，但关于早春季节克氏原螯虾烂尾病的病原研究鲜有报道。2020年4月，江苏省扬州市某养殖场克氏原螯虾出现烂尾症状，病虾尾扇部位出现肉质肿胀和灼烧状疤痕，病虾正常摄食，除尾扇边缘溃烂外，体表和内脏均无明显病变，经光学显微镜观察和PCR检测排除真菌、寄生虫和病毒病原。为防止该病原继续发展产生更大危害，笔者采集病虾样本并开展相关研究，为克氏原螯虾疾病预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

患病克氏原螯虾取自江苏省扬州市某养殖场，共计4尾鲜活病虾，平均体质量约20 g。健康克氏原螯虾购自扬州市宝应县某养殖场，平均体质量(20±1) g。

1.2 试剂

营养琼脂培养基购于南通凯恒生物科技发展有限公司；营养肉汤培养基购于南京便诊生物技术有限公司；TaKaRa MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒为TaKaRa公司产品；革兰氏染色试剂盒购于Solarbio公司；动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司；PCR相关试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司，PCR引物也由该公司合成。

1.3 细菌分离

取活体病虾4尾，用无菌接种针蘸取尾部病灶组织于营养琼脂平板上划线，28 ℃培养箱培养24 h，取优势菌落于营养琼脂平板上多次分离纯化，得到2株代表菌株。同时将单菌落接种于营养肉汤培养基中，在28 ℃恒温振荡培养箱中增菌24 h，保存备用。

1.4 感染试验

将健康克氏原螯虾分成2个试验组，分别感染2株分离菌。每个试验组分设5个小组，包括3个感染组和2个对照组，每组设3个平行，每个平行投放8尾虾。3个感染组分别加入1×107、1×108、1×109cfu/mL密度菌悬液各5 mL，并使用无菌剪刀剪除部分尾扇；对照组1加菌液不剪尾扇，菌液密度1×109cfu/mL，对照组2不加菌液剪尾扇。试验中正常投喂饲料，每个养殖桶加水20 L，日换水1/4，试验结束后对发病虾尾扇感染部位进行细菌再分离。

1.5 细菌鉴定

1.5.1 细菌形态和生理生化特性

观察培养基平板上菌落形态，并对纯化培养的病原菌进行革兰氏染色，置于1000倍光学显微镜下观察细菌形态特征。同时测定病原菌蔗糖、半乳糖、尿素、精氨酸、赖氨酸等生理生化指标。

1.5.2 16S rRNA和gyrB基因测序分析

取纯化培养的新鲜菌液，按照试剂盒操作说明分别提取2种细菌的DNA，用细菌通用引物序列F：5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3′和R：5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′[9]对菌株16S rRNA基因进行PCR扩增；gyrB基因引物序列为F：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGN GGNAARTTYGA-3′和R：5′-AGCAGGGTACG GATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC AT-3′[10]。反应体系(25 μL)：上下游引物各0.1 μL，模板2 μL，预混液12.5 μL，无菌双蒸水补齐。PCR反应条件：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。16S rRNA和gyrB基因扩增产物一部分进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，另一部分送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5.3 构建gyrB基因系统发育树

将分离菌的gyrB基因序列提交BLAST检索系统比对，选择相似度较高的菌株基因序列，使用MEGA 7软件邻接法构建gyrB基因系统发育树(自展1000次)。

1.6 细菌相关特性分析

1.6.1 定居因子CFA基因检测

DNA提取方法相同，定居因子CFA基因引物序列为F：5′-TCCAGCGCATTCA-3′和R：5′-TC CAGCCTTCGGCAAACG-3′[11]，退火温度60.5 ℃，反应体系和条件参照1.5.2中16S rRNA和gyrB基因扩增。

1.6.2 几丁质酶chi基因检测

DNA提取方法相同，几丁质酶chi基因引物序列为F：5′-CCAGGCGCCGTGGARRTCRTANSW CA-3′和R：5′-CGTGGACATCGACTGGGARTW YCC-3′[12]，退火温度63 ℃，反应体系和条件参照1.5.2。

1.6.3 药物敏感性检测

试验使用药敏分析试剂板，对恩诺沙星、硫酸新霉素和甲砜霉素等8种常见抗菌药进行药物敏感性分析，筛选有效抗菌药物。参照微量二倍稀释法测定药物最低抑菌质量浓度，药敏试验结果判定参照文献[13]。

2 结 果

2.1 细菌分离

自患病克氏原螯虾病灶部位(图1a)分离出2株具有不同形状和色泽的代表菌株，分别编号为LW2047-1和LW2047-2。

图1 病虾及死亡虾症状Fig.1 Symptoms of diseased and dead red swamp crayfisha.采集病样病灶部位; b.感染组虾尾灼烧状疤痕; c.感染组虾尾溃烂; d.感染组虾尾肉质囊肿; e.对照组1虾尾灼烧状疤痕; f.高密度组死亡虾症状; 箭头表示病灶.a.infection focus of the diseased crayfish sample collected; b.cauterization scar on crayfish tail in infected group; c.rotted part on crayfish tail in infected group; d.fleshy cyst on crayfish tail in infected group; e.cauterization scar on crayfish tail in control group; f.symptoms of dead crayfish in high density group; Arrow shows infection focus.

2.2 人工感染试验

2.2.1 人工感染发病情况

人工感染后饲养10 d，菌株LW2047-1的感染组和对照组均无烂尾症状，高密度感染组出现少量死亡，死亡个体无烂尾症状。菌株LW2047-2各密度感染组均出现烂尾症状，平均发病率分别为70.8%、54.2%和45.8%，对照组1的平均发病率为25%，对照组2未出现烂尾症状(表1)。

表1 人工感染试验的发病情况Tab.1 Morbidity in artificial infection test

2.2.2 病虾及死亡虾症状

在饲养过程中，菌株LW2047-2感染组病虾症状与采集的病虾样症状相似，病虾可以正常摄食，早期尾扇剪切部位出现溃烂和肉质囊肿，后期结痂形成灼烧状疤痕(图1b～d)。在未剪切尾扇的对照组1中同样有小部分虾产生尾部溃烂症状，症状相对较轻(图1e)。在高密度组中有多尾虾严重感染后死亡，在死亡虾尾扇、肝胰腺、鳃和肌肉等组织中均能分离出该种细菌，死亡个体肝胰腺颜色正常，但有蜕壳未遂症状(图1f)。感染试验结束后，从感染组病虾尾部再次分离到与菌株LW2047-2特征相同的菌株。试验结果表明，克氏原螯虾烂尾病病原为菌株LW2047-2。

2.3 细菌鉴定

2.3.1 菌落及细菌形态

分离菌株LW2047-2的菌落为圆形，乳白色，边缘薄，直径为1～2 mm，油亮反光(图2a)。该菌为革兰氏阴性菌，短杆状，两边钝圆，分散排列，偶尔出现菌体黏结成长条状，以单个菌体或多个菌体聚集成团居多(图2b)。

图2 菌株LW2047-2的菌落和细菌形态Fig. 2 Colony and bacterial morphology of strain LW2047-2a.菌落形态; b.细菌形态(1000×).a.colony morphology; b.bacterial morphology (1000×).

2.3.2 生理生化特性

生化鉴定结果显示，菌株LW2047-2各项理化指标符合柠檬酸杆菌(Citrobacter)特性。与《水产养殖动物病原细菌学》[14]相关数据相比，除部分测定项目无数据外，其余结果均一致(表2)。

表2 菌株LW2047-2的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain LW2047-2

2.3.3 16S rRNA基因序列分析

菌株LW2047-2的16S rRNA基因经测序后，得到长度为495 bp的有效序列，将基因序列提交BLAST比对，结果显示，该菌株16S rRNA基因与弗氏柠檬酸杆菌I-M-5-3、CX-100和78B-3相似性最高，达到99.35%，但与柠檬酸杆菌属其他几种菌株的相似性也较高(>98.91%)(表3)。

表3 菌株LW2047-2的16S rRNA基因序列比对结果Tab.3 Result of 16S rRNA gene sequence alignment of LW2047-2

2.3.4 gyrB基因序列及系统发育树分析

菌株LW2047-2的gyrB基因经测序后，得到长度为1144 bp的有效序列。选择嗜水气单胞菌作为外群模式菌，构建gyrB基因系统发育树(图3)。结果显示，菌株LW2047-2与一株弗氏柠檬酸杆菌归为一支。

图3 gyrB基因系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of gyrB gene

2.4 细菌相关特性分析

2.4.1 定居因子CFA基因检测

CFA基因引物扩增出约100 bp的清晰条带，阴性对照为无菌水(图4a)。检测结果表明，弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2具有定居因子基因CFA，可以表达产生毒力因子黏附素。

2.4.2 几丁质酶chi基因检测

chi基因引物扩增出的条带大小约为250 bp，引物特异性好，无杂带，条带大小与目的片段一致，阴性对照为无菌水(图4b)。检测结果表明，弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2具有几丁质酶基因chi，可以表达产生几丁质酶。

图4 CFA基因和chi基因序列扩增结果Fig.4 PCR amplification of CFA gene and chi genea.CFA基因扩增; b.chi基因扩增; M.DL2000 DNA Maker; 1.弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2扩增产物; 2.无菌水.a.Amplification of CFA gene; b.Amplification of chi gene; M.DL2000 DNA Maker; 1.PCR product of C. freundii LW2047-2; 2.Sterile water

2.4.3 药物敏感性检测

利用药敏分析试剂板测定弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2的药物敏感性(表4)。结果表明，该菌株对恩诺沙星和硫酸新霉素高度敏感，对磺胺类药物不敏感，对氟苯尼考和盐酸多西环素中度敏感。

表4 弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2的药物敏感性Tab.4 Antimicrobial sensitivity of C. freundii LW2047-2

3 讨 论

3.1 弗氏柠檬酸杆菌的免疫学特性

弗氏柠檬酸杆菌属肠杆菌科，菌体呈杆状，半透明或不透明，表面有光泽，边缘不整齐，不产生吲哚，是一种革兰氏阴性、氧化酶阴性的发酵产气杆菌。该菌为条件致病菌，需氧或兼性厌氧，在光学显微镜下多为单个或双个散状排列，电镜下可见其鞭毛，无芽孢和荚膜[14-15]。弗氏柠檬酸杆菌作为一种水产动物常见病原菌广泛存在于自然环境中，如土壤、水、污水及食物等，是一种监测水体污染的重要细菌学指标[16]。本试验表明，克氏原螯虾烂尾病病原为弗氏柠檬酸杆菌，关于该菌的研究较为常见，但鲜见其引发克氏原螯虾烂尾病的报道。

弗氏柠檬酸杆菌的毒力因子主要包括溶血素、内毒素、蛋白水解酶、几丁质酶和黏附素[12,17-18]。笔者针对克氏原螯虾作为甲壳动物具有几丁质外壳的特征，结合该细菌感染尾扇后固定繁殖的特点，选取几丁质酶和黏附素两种毒力因子做深入研究。黏附素又称定居因子，Minkara等[19]研究发现，弗氏柠檬酸杆菌可通过尿素酶分解尿素，在肠道黏膜表面附着固定以对抗恶劣的外界环境，尿素酶便是一种重要的黏附素；肖宁等[18]检测了一株克氏原螯虾源弗氏柠檬酸杆菌的细胞黏附性，发现该菌可黏附于鲤(Cyprinuscarpio)上皮瘤细胞(EPC)周围，并逐渐产生致病性，最终使细胞死亡；阎斌伦等[20]对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)源弗氏柠檬酸杆菌的定居因子抗原基因进行检测，发现该菌具有定居因子抗原CFA基因。本试验中，同样扩增出弗氏柠檬酸杆菌LW-2047-2的CFA基因，片段大小约100 bp，证明该菌株很可能具有黏附在受损组织或细胞周围的特性，能在伤口处固定繁殖，形成囊肿或溃烂。除了黏附素，另一种毒力因子为几丁质酶，关于弗氏柠檬酸杆菌分泌几丁质酶的研究报道较少，Xu等[12]自大黄鱼(Larimichthyscrocea)肠道中分离出一株可分解几丁质的弗氏柠檬酸杆菌，并克隆了该菌的几丁质酶chi-X基因，最终在大肠杆菌中成功表达，表达蛋白可分解胶体几丁质。本试验中，同样在弗氏柠檬酸杆菌LW2047-2中检测出几丁质酶chi基因，证明弗氏柠檬酸杆菌能产生几丁质酶，腐蚀克氏原螯虾几丁质外壳。在人工感染试验中，对照组中尾扇完整的虾同样发生轻度尾扇溃烂，这可能与该菌分泌几丁质酶的特性有关。

3.2 弗氏柠檬酸杆菌的致病性

弗氏柠檬酸杆菌作为人类肠道中的正常菌群，是一种兼性厌氧的条件致病菌。Barnes等[21]最早于1946年报道该菌与人的腹泻有关。近年来，随着水产养殖业的迅速发展，由弗氏柠檬酸杆菌引起的水生动物病害报道越来越多。如2012年，弗氏柠檬酸杆菌引起安徽省全椒县两家稻田养殖场养殖的克氏原螯虾暴发性死亡[22]；2016年，柳州市柳城县一家养殖场罗非鱼大量死亡，经鉴定后确定病原菌为弗氏柠檬酸杆菌[23]；同样在2016年，安徽省当涂县河道拦网养殖克氏原螯虾大量发病死亡，病原菌为弗氏柠檬酸杆菌[18]。

弗氏柠檬酸杆菌作为鱼类病原菌最早被报道于1982年，Sato等[24]研究发现，该菌为日本水族箱中翻车鲀(Molamola)的病原菌，病鱼表现出体表出血、腐烂，并伴有脾脏红肿、肝脏色淡和肠炎等症状；Sanz等[25-26]分别报道该菌与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的病害有关，可引起鱼体体表溃烂、肝脏发白和脾脏发黑等症状，同时影响肠胃系统。弗氏柠檬酸杆菌作为甲壳动物病原菌也有报道，肖宁等[18]从患病克氏原螯虾肝胰腺中分离出一株弗氏柠檬酸杆菌，该菌引起克氏原螯虾肌肉肿胀，同时导致心脏出现色素沉着，肝胰腺颜色变深；沈锦玉等[27]研究发现，弗氏柠檬酸杆菌可引起红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)死亡，死虾尾部肿胀，并结有疤痕，这与本试验中克氏原螯虾烂尾症状十分相似；阎斌伦等[20]自病死三疣梭子蟹体内分离出一株弗氏柠檬酸杆菌，该菌可引起蟹体肌肉糜烂、肝胰腺和肌肉组织水肿；黄晓东等[28]通过回感试验，发现弗氏柠檬酸杆菌会引起中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)黑鳃和肝胰腺呈浅黄色症状。克氏原螯虾具有与上述甲壳动物相似的生理结构和相近的种属关系，但与上述研究结果不同的是，在本次人工感染试验中，高密度组病死虾的肝胰腺并未出现褪色或颜色加深，说明在早春季节，水温较低、溶解氧条件较好时，该菌致病性较弱，主要影响甲壳受损的虾，造成体表溃烂等症状，后期致病性可能受环境和温度影响增强，引起虾体内脏病变和死亡。此外，弗氏柠檬酸杆菌还可侵染蛙、鳖和贝类等[29-31]多种水生动物。

3.3 弗氏柠檬酸杆菌的药物敏感性

在水产养殖业中，抗菌药物可直接杀灭细菌，达到防病治病的效果，而不同细菌的药物敏感度各不相同。因此，分析病原菌的药物敏感性对疾病防控和养殖生产指导具有重要意义。陈红莲等[22]检测出克氏原螯虾源弗氏柠檬酸杆菌对7种喹诺酮类、5种氨基糖苷类药物和头孢他啶敏感，对5种抗菌药物具有耐药性；沈锦玉等[27]分离出的红螯螯虾源弗氏柠檬酸杆菌L1和L2对复方新诺明、丁胺卡那等7种抗菌药物敏感；林启存等[30]从中华鳖(Trionyxsinensis)中分离出的弗氏柠檬酸杆菌对复方新诺明和四环素耐药，对庆大霉素、左旋氧氟沙星和丁胺卡那霉素等药物敏感；万彪等[32]从瓯江彩鲤(Cyprinuscarpiovar.color)中分离的弗氏柠檬酸杆菌GZMT2013-CF对恩诺沙星、头孢噻呋和庆大霉素等7种抗生素高度敏感，对磺胺类药物具有抗性。本试验的药敏试验结果显示，弗氏柠檬酸杆菌LW-2047-2对恩诺沙星和硫酸新霉素敏感，这与黄晓东等[28]药敏试验结果相似，生产中可使用恩诺沙星和硫酸新霉素等药物来减少此类疾病的发生。另一方面，弗氏柠檬酸杆菌在水产养殖中已经产生不同程度的耐药性，养殖户需灵活使用不同抗菌药物，相关研发部门也应尽快研发如中草药免疫制剂和可抑制病原菌毒力基因表达或阻断毒素传递的新型药物。

4 结 论

试验结果表明，引发克氏原螯虾烂尾病的病原为弗氏柠檬酸杆菌。该菌具有较强的致病性，不仅会侵蚀克氏原螯虾的几丁质外壳，造成尾部组织红肿、溃烂，严重感染时还可能直接引起病虾死亡。在养殖过程中，尤其需要注意弗氏柠檬酸杆菌在早春季节的潜在危害，提前做好防范措施，秉承“预防为主，防重于治”的疾病防治理念。在养殖生产中可使用恩诺沙星和硫酸新霉素进行防治。