中华跌打丸中药材鬼画符、丁茄根水提取物的急性毒性试验研究

刘 佩，钟 鸣，曾宪彪，王 丽，吕纪华，邓聿胤

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药研究院，广西 南宁 530022）

中华跌打丸是广西高新技术产品，由广西梧州制药（集团）股份有限公司生产。该中成药由金不换、鹅不食草、牛尾菜、牛膝、红杜仲、刘寄奴、过岗龙、穿破石、毛两面针、鸡血藤、岗梅、木鳖子、丁茄根、鬼画符等32味中草药组成，具有活血祛瘀、消肿止痛、止血生肌、抗氧化、抗疲劳、增加免疫功能、促进骨折愈合及软组织损伤后修复等功效，临床广泛应用于骨关节炎、乳腺炎、皮肤病、软组织损伤、骨折、消化性溃疡等临床病症［1-4］。但近年来有文献报道中华跌打丸存在损害胃肠系统、皮肤瘙痒等不良反应［5］。本研究对中华跌打丸中丁茄根、鬼画符药材进行急性毒性实验研究，初步探讨其安全性及毒副作用，为中华跌打丸的临床安全用药提供客观依据。

1 实验材料

1.1 药物 丁茄根水提取物（冻干粉，批号：20190528），由广西梧州制药（集团）股份有限公司提供，每1 g 冻干粉相当于18.2 g 丁茄根药材，真空密封包装后置2~8 ℃干燥遮光环境下保存，实验时以蒸馏水配制成相应浓度。鬼画符水提取物（冻干粉，批号：20190901），由广西梧州制药（集团）股份有限公司出品，每1 g 冻干粉相当于17.4 g 鬼画符干药材，真空密封包装后置2~8 ℃干燥遮光环境下保存。以小鼠灌胃针能抽吸为限，最高配制浓度为0.3 g 冻干粉/ml，相当于每毫升含5.22 g生药。

1.2 动物 健康性成熟昆明种小白鼠，SPF 级，6～8周龄，体质量18~22 g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004；使用许可证号：SYXK 桂2016-0006。小鼠饲养环境：温度为（23±2）℃，湿度为（70±5）%。

2 方法与结果

2.1 试验方法 按《药理实验方法学》［6］中急性毒性试验有关方法进行操作。

2.1.1 丁茄根水提取物小鼠灌胃最大耐受量试验 精密称取丁茄根冻干粉适量，用蒸馏水配成9.36 g/ml、8.89 g/ml、8.45 g/ml、8.03 g/ml浓度药液，即配即用。取100 只KM 小鼠，随机分为5 组，即药物 A、B、C、D 组及对照组，每组20 只（雌、雄各半）。药物A、B、C、D 组分别予以不同浓度丁茄根水提取物灌胃，剂量分别为374.50 g/kg、355.78 g/kg、337.99 g/kg、321.09 g/kg，灌胃体积为40 ml/kg，每天灌胃1次。给药后立即记录小鼠中毒死亡情况，观察小鼠毛色、四肢活动、进食、饮水、粪便等情况，共14 d。

2.1.2 鬼画符水提取物小鼠灌胃急性毒性试验 精密称取鬼画符冻干粉适量，用蒸馏水配成4.5 g/ml、3.8 g/ml、3.2 g/ml、2.7 g/ml、2.3 g/ml、2.0 g/ml、1.7 g/ml、1.5 g/ml浓度药液，备用。根据预试验结果，设计8个给药剂量组。取合格小鼠90 只，随机分为8 个剂量组，每组10只（雌、雄各半），剩余10 只小鼠作统计外给药和病理检查用。各剂量组小鼠分别灌胃上述不同浓度的鬼画符水提取物（冻干粉）溶液35 ml/kg，剂量分别为157.5 g/kg、133.0 g/kg、112.0 g/kg、94.5 g/kg、80.5 g/kg、70.0 g/kg、59.5 g/kg、52.5 g/kg。使最高给药剂量等于最小100%致死剂量（157.5 g/kg），最低给药剂量约等于最大0%致死剂量（52.5 g/kg），相邻两个剂量组间的剂量比值约为1∶0.85。此外，选择几个适当剂量（157.5 g/kg、133.0 g/kg、80.5 g/kg）给适量统计外小鼠灌胃给药，同法试验，供组织病理检查用。观察给药后14 d内各组动物中毒反应和死亡情况。于给药后2 d，取新死亡小鼠或统计外濒死小鼠肝、肾器官，用10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE 染色，作组织病理检查。给药14 d 后处死存活小鼠，取肝脏同法切片，HE 染色或天狼猩红染色，作组织病理检查。根据给药后14 d 内小鼠死亡率查机率单位与权重系数表，找出各组小鼠死亡机率单位，给药剂量换算成剂量对数，以剂量对数为X轴，机率单位为Y轴，作图检查两者线性关系。依据剂量对数与死亡机率单位关系计算半数致死剂量（LD50）、半数致死剂量（LD50）的95%平均可信限及99%平均可信限。

2.2 结果

2.2.1 丁茄根水提取物最大耐受量试验结果 小鼠灌胃给药后出现饮食欠佳、少动等症状，14 d 后，药物A、B 组小鼠出现死亡，药物C、D 组小鼠未见死亡，提示丁茄根水提取物（冻干粉）小鼠最大耐受量为337.99 g/kg，见表1。

表1 丁茄根水提取物最大耐受量试验结果

2.2.2 鬼画符水提取物半数致死量试验结果 见表2、表3。小鼠灌胃给药后出现饮食欠佳、少动等症状，次日后相继有小鼠死亡，死亡小鼠多集中在给药后2～3 d。给药后4 d 期间，存活小鼠饮食与体重增长欠佳，高剂量组尤为显著，低剂量组次之。给药4 d后，存活小鼠饮食和活动基本恢复正常，且都存活至给药后14 d。各组小鼠死亡数与给药剂量呈正相关，剂量越大，死亡越多，最高剂量组死亡率大于70%，最低剂量组死亡率小于30%（表2）。当给药剂量在94.5～59.5 g/kg区间时，剂量对数（1.9754～1.7745）与死亡机率单位（5.842～4.158）之间呈近似线性关系，回归直线方程式为Y=9.555 1X-13.195。依照剂量对数和死亡机率单位等数据（表3），用综合法计算得半数致死剂量（LD50）为80.209 g/kg，半数致死剂量（LD50）的95%平均可信限为（80.209±7.778）g/kg，半数致死剂量（LD50）的99%平均可信限为（80.209±10.198）g/kg。

表2 鬼画符水提取物半数致死量试验结果 （n=10）

表3 鬼画符水提取物小鼠急性毒性剂量对数和死亡机率单位的线性关系 （n=10）

2.2.3 小鼠肝肾病理检查结果 给药后2 d，肝、肾等主要器官，肉眼下可见小鼠肝脏呈灰白色改变，病理镜下显示肝细胞水肿、变性、坏死。且此病理改变与给药剂量呈正相关，剂量越大病变范围越大，甚至超出肝小叶范围，相邻的病变肝细胞连成广泛性水肿、变性、坏死等细胞病理改变，见图1。157.5 g/kg 组在100倍镜下显示，小鼠肝细胞广泛性水肿、变性、坏死，病变范围超出肝小叶，相邻的病变相互融合，条索状肝小叶组织结构消失（图1-A）；在400 倍镜下显示水肿肝细胞变圆变大，胞质稀疏或空泡化，细胞质着色浅淡，肝细胞水肿、变性、坏死，病变肝细胞无序排列（图1-B）。80.5 g/kg 组在100 倍镜下显示，肝细胞水肿、变性、部分坏死，累及大部份肝小叶，条索状肝小叶组织结构尚可分辨（图1-C）；在400 倍镜下显示水肿或变性肝细胞变圆变大，胞质稀疏或空泡化，肝细胞水肿、变性、坏死。肝细胞有序排列，可区分条索状肝小叶组织结构（图1-D）。

图1 给药2 d后小鼠肝脏病理改变（HE染色）

给药后14 d，病理可见细胞质着色变浅等肝细胞变性改变和散在点状肝细胞坏死，细胞变性范围与给药剂量呈正相关，剂量越大病变范围越大，甚至超出肝小叶范围（图2），天狼猩红染色切片未见明显肝组织纤维化改变。157.5 g/kg 组小鼠肝组织在100 倍镜下显示，变性肝细胞着色变浅、片状分布，条索状肝小叶组织结构完整（图2-A）；在400 倍镜下显示变性肝细胞呈多边形，胞质着色浅淡，肝细胞有序排列（图2-B）。80.5 g/kg 组小鼠肝组织在100 倍镜下显示，变性肝细胞着色变浅、片状分布，条索状肝小叶组织结构完整（图2-C）；在400 倍镜下显示变性肝细胞呈多边形，胞质着色浅薄，肝细胞有序排列，坏死肝细胞散在点状分布（图2-D）。

图2 给药14 d后小鼠肝脏病理改变（HE染色）

给药后2 d，显微镜下见157.5 g/kg 组小鼠肾组织切片，肾小球和肾小管未见明显异常（图3）。

图3 给药2 d后小鼠肾脏病理切片（HE染色）

3 讨 论

丁茄根来源为茄科植物水茄（Solanum torvum Swartz.）的干燥根及老茎，性微温、味辛、微苦、有小毒，具有活血散瘀、消肿止痛之功效，主治胃痛、牙痛、风湿痛、疮毒等疾病［7］。水茄主要含有甾体类、皂苷类、脂肪族等化学成分，对人鼻咽癌细胞株（CNE-1 细胞）、人肺腺癌细胞株（A-549 细胞）、人舌癌细胞株（Tca8113细胞）和人肝癌细胞株（HepG-2细胞）等4种肿瘤细胞株有抑制作用，具有一定的抗肿瘤细胞毒性［8-9］。鬼画符为大戟科植物黑面神Breynia fruticosa（L.）Hook.f.的根、嫩枝、叶，又称鬼面叶，分布于广西、广东、浙江、福建等地，其枝、叶和茎皮所含鞣质，茎皮中含量为12.02%［10］。鬼画符性寒，味苦，有毒，具有清湿热毒、祛瘀消肿之功，临床应用广泛，常用于治疗扁桃体炎、慢性支气管炎、湿疹、皮炎、鹤膝风、跌打肿痛等疾病［11］。近年来药理研究还显示鬼画符具有抗急性炎症、抗皮肤I型超敏反应、抑菌等作用［12-13］。

在丁茄根急性毒性试验中，以4 种不同剂量的丁茄根水提取物给药，发现以337.99 g/kg、321.09 g/kg 剂量灌胃后，小鼠无一死亡，表明丁茄根水提取物小鼠最大耐受剂量为337.99 g/kg。鬼画符急性毒性实验研究表明，小鼠灌胃鬼画符水提取物半数致死剂量（LD50）为80.209 g/kg，半数致死剂量（LD50）的95%平均可信限为（80.209±7.778）g/kg，半数致死剂量（LD50）的99%平均可信限为（80.209±10.198）g/kg。小鼠灌胃鬼画符水提取物后早期可发生急性中毒致死，多集中在给药后2~3 d。病理显示给药后2 d，小鼠肝脏病变为肝细胞水肿、变性、坏死。给药后14 d，肝组织病理表现为肝细胞变性、坏死，未见明显肝组织纤维化，药物主要损害小鼠肝脏。上述肝脏病变与给药剂量呈正相关，剂量越大病变范围越大，甚至广泛性肝细胞水肿、变性，或散在点状肝细胞坏死。小鼠死亡与鬼画符水提取物（冻干粉）致小鼠广泛性肝细胞水肿、变性、肝功能急性衰竭有关。

本研究对中华跌打丸中丁茄根、鬼画符两味药进行小鼠灌胃急性毒性试验，初步完善了方剂中丁茄根与鬼画符的毒理学研究，可为中华跌打丸的临床安全用药提供科学依据。