姜黄素抑制库普夫细胞活化作用的机制研究∗

黄珍恺，丁 炜

南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210000

急性肝损伤（acute liver injury，ALI）是在无慢性肝脏疾病的情况下出现急性肝损伤，临床主要表现为凝血功能障碍、黄疸和肝性脑病［1］。最新研究主要是根据黄疸出现和肝性脑病出现之间的间隔来将急性肝损伤分为超急性、急性和亚急性［2-4］。近年来研究发现库普夫细胞（kupffer cells，KCs）在ALI中起着重要作用，KCs可以分泌多种细胞因子加重肝损伤［5］。例如KCs 可以分泌肿 瘤 坏死 因子α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）加重肝脏炎症，促进肝细胞凋亡［6］；分泌单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、CC家族趋化因子配体7（C-C motif chemokine ligand 7，CCL7）促进单核细胞浸润；分泌CXC 家族趋化因子配体1（C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1）、CXC 家族趋化因子配体2（C-XC Motif Chemokine Ligand 2，CXCL2），促进中性粒细胞浸润进一步扩大肝脏炎症［7-8］，因此抑制KCs活化成为治疗急性肝损伤的重要靶点。

姜黄素是姜黄Curcuma longa L. 的主要活性成分，从姜黄的干燥根茎粉中提取。动物实验表明［9-10］，姜黄素对急性肝损伤具有明确的保护作用，但具体机制仍不清楚。本研究拟从体外实验观察姜黄素对KCs 的作用，并以此来解释姜黄素对急性肝损伤的保护作用。

1 材料与仪器

1.1 实验细胞KCs 提取于正常SPF 级雄性C57BL/6小鼠，肝脏KCs的提取和培养采用原位灌注、离体胶原酶消化和梯度离心法，相关步骤参照吴明兵等［11］的操作方法。

1.2 药物及试剂姜黄素（美国abcam 公司，纯度＞95%，HPLC，批号：ab120618）；LPS（美国R&D 公司，批号：L2630）；WB一抗抗体ERK1/2（美国CST公司，批号：8544）；p-ERK1/2（美国CST 公司，批号：4376）；P38（美国CST 公司，批号：8690）；p-P38 抗体（美国CST 公司，批号：8632）；JNK（美国CST 公司，批号：9253）；p-JNK抗体（美国CST公司，批号：9255）；GAPDH（中国Bioworld公司，批号：AP0063）；WB 二抗-辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG（北京世纪康为公司，批号：CW010M）；Trizol 试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：15596-019）；DEPC水（上海碧云天生物公司，批号：R0021）；q-PCR 逆转录（日本TaKaRa公司，批号：号RR420A）；DMEM培养基（美国gibco 公司，批号：C11995500BT）；胎牛血清（美国gibco 公司，批号：10091-148）；双抗（美国gibco 公司，批号：15140-122）；q-PCR 荧光试剂盒（日本TaKaRa公司，批号：RR036A）。

1.3 实验仪器applied biosystems Quant-StudioTM 6 Flex Real-time-PCR 仪（美国Life Technologies）；applied biosystems 2720 Thermal cycler 型RNA 逆转录仪（美国Life Technologies）；PowerPacTMUniversal 型电泳仪（美国BIO-RAD 公司）；Tanon 5200 Multi 型全自动数码凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司）；3111型细胞培养箱（美国Thermo Fisher）；EL-01-220型单模块金属浴（美国major science）；V2 S025型涡旋振荡器（德国IKA），IKA mini G 型微型离心机（德国IKA）；Heraeus Fresco 21 型冷冻高速离心机（美国Thermo Fisher）；Bx60 型生物显微镜（日本Olympus）；T50型匀浆机（德国IKA）。

2 实验方法

2.1 细胞活力实验首先通过细胞毒理实验筛选合适的药物实验浓度：用完全培养基（包含44%DMEM 培养基、5%FBS 和1% 双抗）重悬KCs，调整细胞浓度至5x104/mL。96孔板每孔中加入150 µL细胞悬液，并置于细胞培养箱中培养2 h。在不同的培养孔中分别加入不同浓度姜黄素（0、2.5、5、10、20、40和80 µM），每个浓度设3个副孔，预处理共培养3 h 后，每孔加入400 ng/m LPS，继续在培养箱中孵育12 h。然后将96孔板拿出，将每个孔加入细胞增殖/毒性的试剂（Cell Counting Kit-8，CCK-8）10 µL，继续培养30 min。最后用设定为450 nm波段的酶标仪读取各孔数据。见图1。

图1 姜黄素对KCs活力示意图

2.2 姜黄素干预实验根据姜黄素预实验结果，选取了本次姜黄素实验药物浓度：2.5、5、10 µM。用完全培养基（包含44% DMEM 培养基、5% FBS 和1% 双抗）重悬KCs，调整细胞浓度至5x104/mL。6孔板中分别加入4 mL，并在各孔中加入不同浓度的姜黄素（0、2.5、5、10 µM），每个浓度设3 个副孔，预处理共培养3 h后，每孔加入400 ng/mLLPS，继续在培养箱中孵育12 h。然后收集细胞蛋白和mRNA进行检测相关指标。

2.3 炎症因子和趋化因子mRNA 水平采用实时定量PCR 方法检测KCs 细胞中炎症因子和趋化因子mRNA变化，吸弃KCs培养上清，用4℃预冷的PBS清洗两遍，加入1 mL TRozl进行裂解核蛋白。根据TRIzol试剂操作说明提取细胞中的总RNA，然后根据PrimeScript RT Master Mix 试剂盒操作说明将其转化为cDNA，最后根据SYBR Premix ExTaq试剂盒操作说明在Step-One Plus 上进行了实时定量PCR。每个样本3 个复孔，得到阈循环值（Ct）平均值，计算△△CT值，各个样本的mRNA表达水平均以2-△△CT表示。最终结果由软件自动求出。引物序列号见表1。

表1 引物序列号

2.4 通路蛋白检测采用Western 印迹法检测KCs中细胞通路蛋白，吸弃KCs培养上清，用4℃遇冷的PBS清洗两遍，利用凯基全蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白。用双氰胺酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白质后，用10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白，转移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。将PVDF 膜在3% 牛血清白蛋白（bicinchoninic acid，BSA）中在室温封闭1 h，然后与各种一抗抗体孵育：ERK1/2（1∶2000）、p-ERK1/2（1∶2000）、P38（1∶2000）、p-P38抗体（1∶1000）、JNK（1∶1000）、p-JNK抗体（1∶2000）4℃过夜，TBST洗涤6次，3 min×3次，10 min×3次。然后与羊抗兔IgG二抗（1∶10000）孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入化学发光试剂，并在全自动数码凝胶成像分析系统上发光成像，留取图片，行蛋白半定量分析。

2.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以±s 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 KCs 鉴定体外分离原代细胞后，予以含10%FBS 和1% 双抗的DMEM 培养基中培养。体外培养30 min 后可见KCs 细胞贴壁。培养48 h 后，可见细胞呈现出星型、多角形和梭形，伸出伪足，见图2A。通过流式细胞术检测其纯度，可见KCs 细胞（CD45+F4/80+细胞）比例达95%，见图2B，可用于进一步实验。

图2 体外分离培养小鼠肝脏KCs和流式鉴定

3.2 炎症因子水平与空白对照组相比，LPS 刺激KCs 后炎症因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA表达均明显升高（P＜0.01）。而予以姜黄素预处理之后，KCs表达的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 则显著降低（P＜0.01），且呈现出明显的剂量依赖性，高剂量组TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达较低剂量组和中剂量组明显降低（P＜0.01）。见图3。

图3 姜黄素抑制LPS诱导的KCs分泌炎症因子水平

3.3 趋化因子水平与空白对照组相比，LPS 刺激KCs 后趋化因子CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA表达均明显升高（P＜0.01）。而予以姜黄素预处理之后，KCs表达的炎症因子CXCL1、CXCL2和MCP-1的mRNA则显著降低，且呈现明显的剂量依赖性，高剂量组CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA 表达较低剂量组和中剂量组明显降低（P＜0.01）。见图4。

图4 姜黄素抑制LPS诱导的KCs分泌趋化因子水平

3.4 ERK1/2、P38和JNK通路LPS刺激和姜黄素预处理后ERK1/2、P38和JNK蛋白的总蛋白表达没有变化，但ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平明显升高。通过IPP软件对WB条带进行的灰度值测算，可见姜黄素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK蛋白磷酸化水平具有剂量依赖性。见图5。

图5 姜黄素抑制LPS诱导的信号通路表达

4 讨论

急性肝损伤是世界性的医疗难题，多种病理因素均可以导致急性肝损伤的发生，如药源性的扑热息痛、病毒性的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）和甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus）及酒精等因素［4，12］。在美国，每年接近30 万人因服用扑热息痛而导致急性肝损伤［1］。既往研究发现，药物及酒精引起的急性肝损伤发生机制与肝脏细胞内过度氧化应激有关，而HBV 引起的急性肝损伤和细胞毒性T 细胞过度活化相关［13］。近年来研究发现，固有免疫也参与急性肝损伤，特别是Kupffer 细胞在急性肝损伤中起着重要的作用，抑制Kupffer细胞功能可以缓解肝损伤［5，13］。

近年来对KCs 在急性肝损伤中的作用研究颇多，大量研究表明，其主要是通过分泌炎症相关细胞因子和趋化因子从而加重肝损伤［5，9］。CAMILLE等［14］研究发现，KCs 在肝损伤早期可以被损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子激活后分泌大量促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6。这些促炎因子进一步加重肝脏炎症，促进肝细胞凋亡。KUBES等［15］研究发现，KCs 分泌CXCL1 和CXCL2 趋化中性粒细胞浸润，中性粒细胞浸润后通过死亡受体直接导致肝细胞凋亡［16］。另外，进一步研究发现Kupffer 细胞分泌CCL7 和MCP-1 趋化单核细胞浸润，导致Ly6Chi单核细胞浸润［15］。这些单核细胞浸润后通过分泌促炎和促纤维化细胞因子扩大肝脏炎症，并引起肝脏纤维化［17］。

姜黄素是从姜黄干燥根茎粉中提取的主要活性成分。多项体内、体外实验均证实姜黄素对急性肝损伤具有治疗作用［18-19］。本实验通过姜黄素与KCs 体外实验发现，姜黄素可以抑制LPS 和KCs促炎细胞因子和趋化因子的分泌，提示姜黄素可能通过抑制KCs 分泌促炎细胞因子和趋化因子来减轻肝脏炎症。KCs 活化分泌细胞因子与ERK1/2通路磷酸化相关。本研究发现姜黄素可以降低LPS 和KCs 共培养后ERK1/2 通路磷酸化水平，提示姜黄素可能是通过抑制ERK1/2通路来抑制KCs活化分泌细胞因子。ERK1/2、P38和JNK蛋白通路是公认的巨噬细胞活化、分泌细胞因子和趋化因子的重要细胞通路［20-21］，本研究结果表明姜黄素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平具有剂量依赖性。

综上所述，通过体外实验证实姜黄素可以抑制KCs 活化，减少促炎细胞因子和趋化因子的分泌，解释了姜黄素治疗ALF 的机理。为姜黄素的临床应用提供科学合理的理论依据，也提示了姜黄素可能是治疗急性肝损伤的有效药物之一。