云南核桃丛枝病感病植株内源激素含量变化研究

韩 颖,马建鹏,张 静,梁 晨,杨 斌,赵 宁,

(1.西南林业大学 生命科学学院,昆明 650224;2.大理白族自治州林业和草原有害生物防治检疫局,云南大理 671000;3.西南林业大学 云南省森林灾害预警与控制重点实验室,昆明 650224)

核桃是云南省大力发展的林业产业之一,种植规模、产量、产值均居全国首位,是林农的致富树,摇钱树,为山区林农的脱贫致富奠定了基础。但是由于云南核桃种植树种单一,管理不当,导致病虫害频繁发生,其中核桃丛枝病的危害较为严重,给种植区造成严重的经济损失。

丛枝病(witche’s broom),又称鸟巢病,感病植株表现为生理紊乱、内源激素平衡失调,性状丛枝、叶片卷曲变小、腋芽萌生、巨芽、花果畸形等[1-3]。近年来,国内学者对各种丛枝病的病原鉴定[4-6]、发生规律、传播途径、防治[7-10]等进行了深入的研究。但对丛枝病植株的内源激素含量变化的研究相对较少,对云南核桃丛枝病的研究更是未见报道。

植物感染丛枝病后体内物质发生明显变化,内源激素含量失调,致使植株表现出病害症状。相关研究表明,细胞分裂素类与生长素类比值(C/A值)的变化是植原体引起泡桐等寄主表现丛枝病状的生理学基础[11-14]。何放亭等[13]通过研究C/A值与甘薯丛枝病症状的关系时发现,症状的发生与细胞分裂素含量异常增高有关;陈子文等[15]研究发现造成枣丛枝病症状的原因是由于病株内源细胞分裂素异常增高和生长素含量下降所导致的;万琼莲等[16]测定山黄麻丛枝病感病植株内源激素含量发现内源激素含量平衡失调。植物感染丛枝病后,触发了植株的生理反应,加快了植株丛枝病症状的表型,这种生理变化是病原、内源激素及环境因子间共同作用的结果。不同激素通过复杂的调控网络协同作用于植物生长发育,弄清内源激素的变化规律有助于阐述病原与寄主植物的互作关系。本研究通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法定量检测云南核桃丛枝病植株内源激素含量的变化,弄清感染丛枝病后寄主叶片内源激素含量的变化,为云南核桃丛枝病的致病机理、发生规律及防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集地

样品采自云南3个核桃主产区,分别为楚雄大姚县梁家山核桃基地(N25°44′47″,E101°20′16″)、大理漾濞县马场核桃基地(N25°39′36″,E100°00′59″)、临沧凤庆县三岔河核桃基地(N24°26′13″,E99°55′22.2″)的核桃叶片,树龄均为5龄。

1.2 样品采集方法

每个调查点采取5点法调查取样,每样点随机选取20棵核桃树调查发病情况,共100棵,并对感病植株进行采样[17]。采样时,挑同一部位及同一方向的叶片进行采集。楚雄样点共有17株核桃感病,大理10株,临沧6株,每样树设3个重复采样,同时在每个基地分别采集健康样品3份。液氮冷冻保存带回实验室。

1.3 内源激素的测定

采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法进行内源激素含量的测定,测定激素包括脱落酸(ABA)、生长素类激素(IAA、ME-IAA、ICAId、ICA、IBA、IPA)、细 胞 分 裂 素 类CTK(cZ、t Z、tZR、IP、IPR、DZ、DHZ7G)和 赤 霉 素 类(GA1、GA3、GA4、GA7、GA9、GA15、GA19、GA20、GA24、GA53)。

1.3.1 样本前处理 (1)取液氮保存的感病与健康样品,用研磨仪研磨(30 Hz,1 min)至粉末状;(2)称取50 mg研磨后的样品,加入内标,用1 m LV(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=15∶4∶1,进行提取;(3)提取液浓缩后用100μL 80%甲醇/水溶液复溶,过0.22μm滤膜,置于进样瓶中,用于LC-MS/MS分析。

1.3.2 色谱质谱采集条件 (1)色谱柱:Waters-ACQUITYUPLCHSST3C18柱(1.8μm,100 mm×2.1 mm);(2)流动相:A相,超纯水(加入0.04%的乙酸);B相,乙腈(加入0.04%的乙酸);(3)梯度洗脱程序:0 min A/B为95∶5(V/V),1.0 min A/B为95∶5(V/V),8.0 min为5∶95(V/V),9.0 min为5∶95(V/V),9.1 min为95∶5(V/V),12.0 min为95∶5(V/V);流速0.35 m L/min;柱温40℃;进样量2μL。

1.3.3 定性与定量测定 基于植物标准品构建MWDB(Metware Database)植物激素数据库,对质谱检测的数据进行定性分析。利用三重四级杆质谱的多反应监测模式进行定量分析。获得不同样本的质谱分析数据后,对所有目标物的色谱峰进行积分,通过内标法进行定量分析。

1.4 数据分析

利用SPSS 22.0软件对试验数据进行统计分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 脱落酸的含量变化

脱落酸(ABA)在植物的生长发育中起抑制作用,与促进类激素作用拮抗,促进植物器官的脱落、休眠及气孔关闭。研究表明,植物受到逆境胁迫时ABA含量会提高,以增强植物的抗逆性[18]。表1结果显示,ABA的含量在3个样地的感病叶中明显升高,且较健康叶分别升高1.21、1.23和1.18倍。同一样地的健康叶和感病叶的ABA含量存在显著差异,其中种植基地大理的差异最大,感病株叶片中的ABA含量比健康株叶片中的含量高189.43 ng/g,差异最小的样品是临沧,感病株叶片中的ABA含量比健康株叶片中的含量高148.41 ng/g。

表1 不同种植基地核桃丛枝病内源激素脱落酸含量变化Table1 Changes of the endogenous hormone abscisic acid content of walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

2.2 生长素类激素含量变化

生长素(IAA)是植物生长的主要调节因子,能调节植物细胞的分裂、伸长和分化。表2为生长素类激素及衍生物的含量,除楚雄样品的健康叶和感病叶中的ME-IAA含量及临沧的ICAld含量无明显差异(P＞0.05),其余样品中的健康叶和感病叶内的IAA、ME-IAA和ICAld的含量均存在显著差异,且感病叶片中的含量显著低于健康叶片(P＜0.05)。在同一样品中IAA的含量显著高于ME-IAA,是ME-IAA含量的10倍左右,与ICAld的含量没有差异性。IAA含量最高的是大理的健康叶,含量为10.02 ng/g,比感病叶片的含量高89.41%。

表2 不同种植基地核桃丛枝病内源激素生长素类含量变化Table2 Changes of endogenous hormone auxin content in different planting bases of walnut witches’broom disease ng/g

2.3 细胞分裂素类激素含量变化

细胞分裂素(CTK)是一类能促进细胞分裂、分化、促进种子和芽的萌发、解除植物顶端优势的植物激素,较高含量能导致植株腋芽萌发,生长分化,形成丛枝[19]。表3结果显示,7种细胞分裂素中cZ、tZ、IP、DHZ7G在感病叶中明显升高,其中含量最高的是DHZ7G,楚雄感病叶片中的含量比健康叶片的含量高65.85%;含量最低的是cZ,临沧感病叶片中的含量比健康叶片的含量高166.67%。另外,3种细胞分裂素tZR、IPR、DZ的含量感病叶片中明显降低(P＜0.05),其中tZR的含量在大理感病叶片内比健康叶片中降低22.75%。同一种植地的健康叶和感病叶中除tZ和IP外,其余激素均存在显著性差异,不同激素在同一种植地的健康叶或感病叶中存在显著性差异,且tZR的含量最高,显著高于其他激素的含量(P＜0.05)。表4中感病叶C/A值均高与健康叶,赵锦等[3]的研究表明植原体侵染导致细胞分裂素含量的增加,致使植物产生丛枝病症状。

表3 不同种植基地核桃丛枝病内源激素细胞分裂素类含量变化Table3 Changes of endogenous hormones and cytokinins in walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

表4 健康叶与感病叶C/A比值变化Table4 Changes in C/A ratio between healthy and diseased plants

2.4 赤霉素类激素含量变化

赤霉素(GA)能促进细胞的伸长生长,还能打破植物的休眠,促进发芽和花的形成。通过LCMS/MS共检测出4种赤霉素(表5),3个样地的健康叶片中均未检出GA7,GA3在3个样地的感病叶片和健康叶片中含量无差异(P＞0.05),GA15在3个样地的感病叶片高于健康叶片,除大理外,另外两地存在显著差异,GA24在3个样地的感病叶片中含量低于健康叶片,差异显著(P＜0.05),在大理的健康叶片中检出量最高为8.13 ng/g,比感病叶片高124.59%。

表5 不同种植基地核桃丛枝病内源激素赤霉素类含量变化Table5 Changes of gibberellins content of endogenous hormones of walnut witches’broom disease in different planting bases ng/g

2.5 核桃丛枝病植物内源激素相关性分析

相关性分析发现(表6),ABA与IAA及其衍生物、tZR、DZ和GA24呈显著负相关,与cZ、IP和DHZ7G呈显著的正相关性,表明ABA抑制生长素类激素和赤霉素的合成。ABA是抑制型激素,对生长促进型激素有拮抗作用[20]。生长素和CTK通过调节细胞周期组分来协同调节植物生长发育,且对GA的合成有促进作用,各自呈正向调节。云南核桃感染丛枝病后,叶片内的脱落酸和细胞分裂素含量显著升高,而生长素和赤霉素含量显著下降,激素的失调致使植株不能正常生长,出现典型的丛枝病症状。

表6 不同种植基地核桃丛枝病内源激素含量相关性分析Table6 Correlation analysis of endogenous hormones in walnut witches’broom disease

3 讨论

本研究3个样地的核桃品种不同,楚雄是三台核桃,大理和临沧的是大泡核桃,研究结果表明,核桃丛枝病感病植株与健康植株相比内源激素发生了明显变化,而且不同样地、不同产品间均表现出相似的变化规律。相关文献报道,丛枝病症状的发生可能与细胞分裂素和生长素失调有关[13],感病植株的叶片内细胞分裂素和生长素出现紊乱、失调的现象,因此丛枝的症状与内源激素含量水平关系密切。

ABA能抑制植物生长,在植物受到病害等胁迫时,体内ABA含量增高,使植物在生理生化等方面发生变化。本研究ABA的含量在感病叶中显著高于健康叶,因此ABA的积累可能促使植株出现黄化、小叶、矮化等,表现出丛枝症状。杜绍华等[12]用组培苗研究枣树感染枣丛枝病后内源激素含量变化发现,感病植株内源IAA降低,GA含量升高;冯志敏等[21]对泡桐丛枝病的研究表明,植物体受逆境损伤后内源激素比例失衡而引起组织、器官等分化异常,这与本研究的结果是相一致的。生长素含量降低,可能是健康核桃感病后使体内的IAA氧化酶活性增高导致的,也可能是激素与氨基酸及糖等交联作用降低了激素活性,或是过氧化氢酶的活性受到抑制降低了植物IAA的生物合成[22-24],导致核桃枝节间缩短,侧芽萌发生长,出现典型丛枝症状。感病植株的CTK含量显著高于健康植株,较高含量的CTK可能促使腋芽大量萌发、生长和分化,从而形成丛枝[25]。何放亭等[13]对甘薯丛枝病病株内源激素含量进行分析,发现与健康株相比,病株的细胞分裂素一直处于较高水平,使C/A比值升高;赵锦等[3]测定枣丛枝病不同患病程度叶片中内源激素结果表明,患病程度越重,细胞分裂素越高,C/A比值越高。本研究测试核桃叶片也发现,感病植株的CTK含量也显著高于健康植株,C/A值均高于健康叶。CTK含量的增加可能有利于腋芽的大量萌发,侧芽的生长,引起丛枝病或增值症状[21]。

大量的文献证明,植物感染丛枝病后内源激素含量会发生显著的变化,本研究的结果也证实了这一点。本研究结果表明,云南核桃感染丛枝病后代谢失调,内源激素含量发生显著变化,导致丛枝表型,可为云南核桃丛枝病的研究和防治提供理论依据。