多重荧光PCR技术在诊断儿童急性呼吸道感染中的应用

罗丹 吴佳玲 周前选 潘建华

急性呼吸道感染(acute respiratory infection, ARI)是最常见的儿童急性传染病,也是引起免疫功能不全的重要病因[1]，其中由呼吸道感染引发的死亡是世界十大死因中的第三位(5.9%)，因其感染导致为严重疾病已经成为全球关注的公共卫生问题[2]。引起儿童ARI 的病原体种类较多,涉及多种病毒和细菌，临床症状相似[3-4]，临床医生很难从临床症状做出准确的病因诊断，如何快速精准检测出患者所感染的呼吸道病原体，一直是困扰临床的难点。

本研究采用多重荧光PCR技术对常见的呼吸道病原体靶基因进行扩增和分析，并与其它病原体抗原检测方法进行比较，同时引入基因测序作为金标准进行验证，分析了多重PCR技术在临床中的检测性能和价值，旨在为临床提供更为快速可靠的实验室诊断依据。

资料与方法

一、研究对象

收集长沙市中心医院2019年11月-2020年1月502例具有急性呼吸道感染症状患儿咽拭子样本。临床症状主要为发热、白细胞升高或降低、寒颤、体温降低；咳嗽咳痰、气短、呼吸音异常；伴有或不伴有胸痛及呼吸困难，查体呼吸音粗糙伴有或不伴有湿性啰音，胸部X片或胸部CT扫描等影像学提示呼吸道感染。

二、方法

1 标本收集 收集呼吸道咽拭子样本, 置于相应的无菌样本收集管内立即送检。不能立即检测的标本编号后，置标本保存液中-70℃冷冻保存待检。

2 仪器和试剂 ABI3730测序仪及配套试剂，上海宏石全自动医用荧光定量PCR分析系统，多重PCR联合检测试剂盒(苏州创澜生物科技有限公司)，七项呼吸道病毒检测试剂盒(美国海德诊断有限公司)，甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒(广州万孚生物技术有限公司)。

3 多重PCR检测 多重PCR检测严格按试剂说明书要求进行标本的采集、转运、存储、处理、核酸提取、扩增、结果的软件分析，检测完成后，对期间产生的垃圾废物及废弃标本，严格按生物安全要求进行无害化处理。检测的14种病原体包括：甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)、人副流感病毒(PIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV)、鼻病毒(RV)、冠状病毒(COV)、人偏肺病毒(hMPV)、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌(HI)、肺炎链球菌(Strep)、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体。

4 呼吸道病原抗原检测 呼吸道七项病毒和甲乙流抗原检测严格按照试剂说明书进行，操作规范，对多种病原体进行检测和结果分析。

5 呼吸道病原体测序 取300 μL样本进行核酸提取，提取的核酸溶解于200 μL DEPC水中。150uL提取的核酸，用Takara逆转录酶进行逆转录(48℃ 20 min，95℃ 5 min)；用20 μL对呼吸道病原体测序引物，分别对逆转录产物进行PCR扩增，PCR扩增试剂为诺唯赞的Green PCR mix，PCR条件为95 ℃ 2 min预变性，之后95℃ 20 s，60℃ 40 s进行50个循环的扩增。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如某病原体没有相应大小的扩增产物，直接判读该病原体阴性；如某病原体有相应大小的扩增产物，则将该扩增产物用Applied Biosystems 3730进行测序，并将正/反向测序结果在NCBI上做BLAST分析，如正/反向测序结果有1个与该病原体相符，则判读该病原体阳性，如正反向测序结果均与该病原体不符，则判读该病原体阴性。

三、统计学方法

采用SPSS20.0软件分析，计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05，有统计学意义。计算Kappa统计量对两种方法间的一致性的进行评价，Kappa<0.4,表明一致性较差；0.40.80时，表明有极好的一致性。

结 果

一、患儿基本情况

本次收集的是2019年冬季新冠疫情发生前后的ARI患儿，共502例，年龄中位数为4岁(2～7岁)，男性258例，阳性者占62例，比例为24.03%；女性244例，阳性者占56例，比例为22.95%。男女阳性率比值为1.05:1，两者阳性率差异无统计学意义(χ2=0.032，P=0.857)。

二、多重PCR技术检测结果

在502例样本中，用多重PCR技术共检出10种200株病原体(见图1)，有118 例至少检测出一种呼吸道病原体，阳性率为23.50 %。只检出一种病原体感染的有 61例(占12.20%)，检出二种或以上感染的有57例(占11.40%)，其中2种病原体混合感染的 33例(占6.60%)、3种及以上病原体感染的 24例(占4.80%)。多重感染中，以甲型流感病毒混合感染肺炎链球菌、流感嗜血杆菌鼻、病毒、腺病毒、呼吸道病毒较为常见，其他混合较少。不同病原体在单一感染和混合感染的分布略有不同，按照多重PCR检测出的病原体分类来分析单一感染和混合感染的情况(见图2)。

图1 病原体检测结果(n)

图2 病原体混全感染情况(n)

三、多重PCR检测技术与其它呼吸道抗原检测法的比较

多重PCR技术检测与甲型/乙型流感病毒抗原检测、七项呼吸道病毒检测等结果有差异的，用二代基因测序方法确定检验结果。结果表明：多重PCR检测与二代基因测序的结果完全一致，而免疫学方法漏检率、错检率比较高。呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒等都有漏检，还有8例用免疫学方法检测出的甲型流感病毒，用多重PCR技术和测序方法均未检出，后经临床诊断证实此8例均为假阳性。多重PCR技术与免疫学方法检测呼吸道病原体的检出情况，详细(见表1)。

表1 多重PCR技术与免疫学方法检测呼吸道病原体的检出情况(n)

由表2可见，多重PCR技术较免疫学方法而言，除甲型流感病毒、乙型流感病毒的检测一致性好(kappa>0.8)，其它的如肺炎链球菌、副流感病毒、鼻病毒、流感嗜血杆菌等的检测一致性较差。多重荧光PCR技术检测的灵敏度等方面要明显好于免疫学方法，且十四项病原体联合检测可以一份标本检出多种病原体，具有准确、方便、快速的特点，对临床后续治疗提供更有力的证据支持。

讨 论

长沙属于华中地区，冬季平均气温4～12℃，潮湿寒冷导致呼吸道感染频发，且起病急、传播快、感染力强[5]。患儿感染后因缺乏特异性的表现，临床无法明确诊断,而不得不接受广谱抗生素的治疗[6]。早期明确病原学诊断,不仅可以制定精准的治疗方案，改善预后,帮助患者快速恢复，还可以减轻痛苦，降低家庭经济负担等[7]。

表2 多重PCR联合检测与其它免疫方法检测呼吸道病原体诊断效能

目前，临床上常用的呼吸道病原体检测方法是免疫金标法、免疫荧光法、免疫凝集法、培养法等，但一般一次只能检测一种或两种病原体。对患儿多次取样,会造成家长配合度降低。近年来，随着核酸扩增技术的迅猛发展，多重荧光PCR已发展成熟并应用于临床[8]，广谱呼吸道病原体的核酸检测，已成为新的发展方向。检出阳性率因感染病原体的种类、患者年龄、季节、地域等不同有一定差异[9]。

本研究应用多重PCR技术对502例疑似呼吸道感染患儿的样本进行检测，阳性样本达到118例，阳性率为23.5%，与相关报道一致[10]。单种病原体感染 61例，混合感染57 例，并且以甲型流感病毒、肺炎链球菌混合感染为主。检出的200株病毒中甲型流感病毒的检出率最高，其次是乙型流感病毒,几乎占到检测病原体的75%，与有关报道类似[11-14]，而与乌鲁木齐、成都等地区有差异[10，15]。

本次研究发现，多重荧光PCR技术与基因测序结果高度一致，较金标法、荧光法等免疫方法，在灵敏度、特异性、误诊率等分析性能指标上都有优势，尤其传统免疫方法漏检率较高、操作十分繁琐、结果判读主观性强。

综上所述，呼吸道病原体多重PCR检测技术较传统的检测手段快速、敏感、简便、覆盖面广，具有更高检测效率，更真实反映病原体定植增殖状态。快速准确的筛查手段有利于临床精准诊断、指导合理用药，值得在临床工作中推广。