手术切除肺腺癌患者免疫细胞浸润分析及预后关系

孙如坤 刘岩 潘春香 胡祥坤 鹿敏

我国肺癌发病和死亡人数在恶性肿瘤中居首位[1]。早期非小细胞肺癌患者术后5年生存率约70%，约30%的手术患者会复发，且两年生存率仅为17%[2]。肺癌组织除肿瘤细胞外，还存在多种基质细胞和免疫细胞，共同组成免疫抑制微环境[3]。肿瘤免疫细胞主要为：肿瘤浸润淋巴细胞，肿瘤相关巨噬细胞，髓样抑制细胞和树突状细胞[4]。不同免疫细胞在肿瘤发生发展中扮演不同作用[5-6]。不同肿瘤免疫微环境直接影响预后，通过分析免疫细胞浸润模式，可以建立准确的预后预测模型[7]。目前免疫细胞分析主要集中在晚期患者，早期手术患者免疫细胞浸润与预后关系研究鲜有报道，本研究基于GEO数据集分析手术切除肺腺癌免疫浸免疫浸润特征及其与预后的关系。

资料与方法

一、数据下载与处理

利用R软件(V 4.0.2)从GEO数据库中下载GSE68465数据集，该数据集基于GPL96芯片平台，共462个样本，其中肺腺癌样本442例，和20例正常组织样本，利用R包将探针名转换为基因名，得到12402个基因的表达数据用于后续分析。

二、免疫细胞浸润分析

免疫细胞浸润分析采用CIBERSORT算法[8]，利用R软件加载CIBERSORT分析包、LM22参考基因集和未标准化的GSE68465芯片表达谱数据，对样本中22种免疫细胞进行定量分析，每个样本的22种细胞比例之和为1，各细胞占的百分比代表该类型免疫细胞在样本中的浸润水平，根据P值小于0.05选择结果可信的样本，用于后续可视化和预后分析。

三、生存分析

在R软件中，利用Survival包，对22种免疫细胞依次进行生存分析，以CIBERSORT计算的细胞比例中位数将患者分为高浸润组和低浸润组，以总生存率(OS)为生存指标，绘制Kaplan-Meier(KM)曲线，Log Rank检验两组间生存曲线差异，P<0.05认为差异显著。

四、基于免疫细胞浸润构建预后风险模型

在R软件中，利用Survival包，对22种免疫细胞依次单变量Cox回归分析，选择P值小于0.05的免疫细胞进行Cox 多变量回归分析，构建肺腺癌手术患者免疫细胞预后风险模型，根据风险评分(Risk score)中位数将分为高风险组(High risk)和低风险组(Low risk)，并绘制Kaplan-Meier生存曲线和受试者工作特征(ROC)曲线，评估免疫细胞预后风险模型的预测效果。

结 果

一、肺癌组织免疫细胞浸润分析

GSE68465数据集共包含462个样本，其中肺腺癌样本442例，和20例正常组织样本，用CIBERSORT算法，筛选出具有CIBERSORT输出P值小于0.05的样本进行研究，本研究中所有样本P值均小于0.05。(图1)为所有样本中22种免疫细胞比例。其中比例最高的三种免疫细胞是浆细胞(Plasma cells)、M2巨噬细胞(Macrophages M2)和M0巨噬细胞(Macrophages M0)。

图1 肺腺癌组织免疫细胞浸润情况

二、肺癌组织与正常肺组织免疫细胞浸润差异比较

进一步比较肺腺癌组织与正常肺组织的22种免疫浸润细胞差异(图2)，结果显示18种免疫细胞浸润比例均与正常肺组织有显著差异(P<0.0001)，其中肺癌组织中比例显著升高的有初始B细胞、浆细胞、活化CD4+记忆T细胞、调节性T细胞、γδT细胞、活化NK细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化树突状细胞、静息肥大细胞和中性粒细胞，比例显著下降的细胞有初始CD4+T细胞、静息NK细胞、单核细胞、静息树突状细胞、活化肥大细胞和嗜酸性粒细胞。进一步通过主成分分析(PCA)，结果显示(图3)，肺腺癌样本与正常肺组织样本分布明显不同。以上结果提示肺腺癌组织与正常组织免疫浸润模式显著不同。

图2 肺腺癌组织与正常组织免疫细胞浸润比较。LUAD：肺腺癌组织；Normal：正常肺组织；****表示P<0.0001

图3 基于免疫浸润细胞PCA图

三、肺腺癌组织免疫细胞浸润的预后价值

选择434例有预后数据的肺腺癌样本，包括273例Ⅰ期患者(64.4%)，94例Ⅱ期患者(22.2%)和67例Ⅲ期患者(14.8%)，利用Kaplan-Meier分析评估22种免疫细胞在肺腺癌手术患者中的预后价值，如图4所示，仅静息NK细胞与预后关系显著(P<0.05)，静息NK细胞升高提示术后总生存期低，是独立的预后因子，其他类型免疫细胞对预后的影响均不显著(P>0.05)。

图4 免疫细胞浸润与肺腺癌手术患者预后关系

四、基于免疫细胞浸润构建预后风险回归模型

对22种免疫浸润细胞，进行单变量Cox回归分析，其中静息NK细胞(NK cells resting)、活化CD4+记忆T细胞(T cells CD4 memory activated)、活化肥大细胞(Mast cells activated)、M0巨噬细胞(Macrophages M0)、活化树突状细胞(Dendritic cells activated)和浆细胞(Plasma cells)等6种类型免疫细胞与预后关系显著(P<0.05)。基于这6种免疫细胞进行逐步回归分析，建立最优预后评分模型，Cox回归结果(见表1)。最终得到5种免疫细胞的预后风险模型，公式为Risk Score=8.156×(静息NK细胞)+9.059×(活化CD4+记忆T细胞 )+ 3.899×(静息肥大细胞 )+ 2.452× (M0巨噬细胞)+5.575×(活化树突状细胞)，5种免疫细胞均为β>0且HR>1，表明均为预后风险因素。根据风险评分模型，计算每个样本的风险评分，根据风险得分分为高风险组和低风险组，利用Kaplan-Meier分析两组患者总生存期差异，结果显示高风险组患者预后与低风险组相比显著较差(图5，P<0.0001)，绘制ROC曲线评估风险模型的预测能力，结果显示1年、3年和5年生存的AUC面积为分别0.905、0.698和0.761，提示该风险评分模型可以可靠地预测患者预后(见图6)。

表1 多变量Cox回归

图5 高风险和低风险组总生存期Kaplan-Meier曲线

图6 免疫风险评分模型的ROC曲线

讨 论

对于早期肺腺癌患者，手术治疗是患者最佳的治疗选择，基于美国癌症联合委员会(AJCC)的TNM分期系统与术后生存显著相关，目前临床根据TNM分期对早期肺腺癌进行分层治疗，但TNM分期越高，预后越差，5年生存率显著降低，以铂类为主的辅助化疗对Ⅱ期和ⅢA期患者的5年生存期有显著改善[9-10]，对ⅢA期患者，以免疫检查点抑制剂的新辅助疗法对已经有相关的临床试验在开展中，但目前为止尚未得到有效的数据。因此，开发新的肺癌术后预测分子标志物具有重要意义，有助于对早期肺腺癌患者进行风险分层，筛选预后差和复发风险高的人群，辅助化疗或新的免疫辅助疗法有可能改善这类人群的预后。

近年来，越来越多的研究表明，免疫微环境在肺癌的发展和恶化中扮演着重要角色。本研究中，我们利用生物信息学手段，评估了早期肺腺癌患者的免疫细胞浸润情况，PCA分析结果表明肺癌组织与正常肺组织的免疫细胞情况有明显差异，揭示肺腺癌组织在早期就形成了特定的免疫微环境[11]，早期肺癌组织中，比例最高的3种免疫细胞是浆细胞、M2巨噬细胞和M0巨噬细胞。巨噬细胞作为肿瘤组织中主要的免疫浸润细胞，是调控肿瘤和炎症的关键细胞类型[12]。巨噬细胞的主要状态是经典活化的巨噬细胞(M1)和替代性活化的巨噬细胞(M2)，巨噬细胞具有抑制或促进肿瘤的两极分化表现，M1巨噬细胞激活产生细胞因子，募集T细胞，最终吞噬肿瘤细胞；而M2巨噬细胞具有相反的作用，促进肿瘤免疫抑制[13]。进一步分析22种免疫细胞与患者总生存期的关系，仅发现静息NK细胞对预后影响显著，静息NK细胞含量高提示预后差，且CIBERSORT分析得出肺癌组织静息NK细胞比例显著低于正常组织。一项针对肺癌组织的单细胞测序研究提示，静息NK在肺癌组织中的比例显著低于正常组织[14]，此外，Li 等利用Cox回归建立的肺癌10基因预后模型中，低风险组静息NK细胞比例显著低于高风险组[15]，目前，NK细胞与肿瘤的发展和转移的关系尚未完全阐明，研究显示暴露于癌细胞中的NK细胞会表现为未活化状态并促进癌细胞的增殖和转移[16]，因此未活化的NK细胞可能是肺癌的独立预后因素和潜在免疫治疗靶点。进一步，我们通过单变量和多变量Cox回归，建立了基于5种免疫细胞的肺腺癌手术患者预后风险评分模型，基于该模型得到的低风险组预后显著好于高风险组，ROC曲线结果也证明该模型可以有效地预测患者预后。近年来，大量研究报道了基于免疫细胞的风险评分模型是一种有效的预后预测工具，并在多种癌症中得到证明，但其在临床实践中应用的可行性还需大量的验证工作[17]。

总之，本研究利用生物信息学手段，分析了肺腺癌组织中免疫细胞浸润情况及与术后生存的关系，利用单变量和多变量Cox回归分析筛选预后相关的免疫细胞类型并构建预后风险评分模型，表明免疫浸润模型是一种有效的肺腺癌手术患者预后预测手段。