免疫检查点抑制剂联合放化疗治疗非小细胞肺癌的疗效预测标志物研究进展

陈鸿志 周永慧 李燕 苗立云

肺癌已成为我国死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占肺癌的85%～90%，且发病率呈逐年增高趋势[1]。大多数非小细胞肺癌诊断时已出现远处转移，无法手术治疗。放疗、化疗、靶向治疗和抗血管生成治疗是晚期非小细胞肺癌患者的主要治疗方法。而肿瘤免疫治疗在肺癌中的应用既往一直未有突破性的进展，其治疗策略主要集中于直接提高抗肿瘤主动免疫(如过继性细胞免疫治疗)[2]。随着对肿瘤免疫微环境研究的深入，免疫检查点(immune checkpoint)在肿瘤免疫逃逸中的作用逐渐被重视，而针对免疫检查点的抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)开始进入临床应用，并显示出一定的治疗效果。其中，程序性死亡受体-1/配体-L1(programmed cell death 1，PD-1/Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)抑制剂已经获批应用于晚期非小细胞肺癌的治疗。

然而，免疫检查点抑制剂(ICIs)单药治疗虽然有缓解期长等一些优点，但总体客观有效率仍偏低。一些生物标志物的检测可以预测免疫检查点抑制剂的疗效，目前推荐ICIs使用前，需明确免疫检查点相关分子(如PD-L1)的表达水平，以提前发现目标获益人群。这在一定程度上解决了ICIs盲目应用的问题，但单药应用获益人群比例不高。近年来，多项临床研究表明ICIs联合常规放、化疗能够显著改善晚期非小细胞肺癌患者的预后，这为ICIs的临床应用扩大了适应证，但预测ICIs单药治疗疗效的生物标志物是否可用来指导其联合常规放、化疗尚不明确，如何筛选获益较大的人群是目前临床面临的主要问题。本文就PD-1/PD-L1抑制剂及其与放、化疗联合应用的疗效预测标志物进行综述。

PD-1/PD-L1抑制剂的作用机制

免疫逃逸是恶性肿瘤的十大特征之一，导致肿瘤免疫逃逸的原因是肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因素，其中包括免疫检查点(immune checkpoint)的配体与受体结合、抑制细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)活化。免疫检查点是一大类表达于免疫细胞、抗原递呈细胞、肿瘤细胞等并发挥抑制或激活获得性免疫系统的分子，包括CTLA-4、PD-1、PDL-1、LAG3、B7-H3、TIM3等[3]。

PD-1属于CD28免疫球蛋白超家族的共抑制分子，其编码基因PDCD1位于2号染色体,主要表达在激活的T细胞、B细胞表面和自然杀伤细胞表面，与程序性死亡蛋白配体-1(PD-L1)或程序性死亡蛋白配体-2(PD-L2)结合，抑制T细胞的抗肿瘤活性，所以PD-1/PD-L1信号通路成为抗肿瘤治疗的重要靶点[4]。PD-L1在肿瘤细胞、免疫细胞、上皮细胞和内皮细胞都有表达，而PD-L2主要在激活的巨噬细胞和树突状细胞上表达。表达于肿瘤细胞或其他肿瘤间质细胞表面的PD-L1可以作用于CTL细胞表面受体PD-1，通过抑制PI3K/Akt和Ras-MEK-ERK信号通路抑制T淋巴细胞增殖、促进T淋巴细胞凋亡[5]。PD-1/PD-L1单抗通过阻断PD-1和PD-L1的结合，解除CTL细胞的免疫抑制，恢复CTL细胞的抗肿瘤免疫功能。

目前国内外针对PD-1/PD-L1的抑制剂已有数种，主要包括PD-1单抗国外的Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、Nivolumab(纳武利尤单抗)、国内的Cemiplimab(西米普利单抗)、Tislelizumab(替雷利珠单抗)、Toripalimab(特瑞普利单抗)、Sintilimab(信迪利单抗)、Camrelizumab(卡瑞利珠单抗)和PD-L1单抗国外的Durvalumab(度伐利尤单抗)、Atezolizumab(阿替利珠单抗)、Avelumab(阿维鲁单抗)等。其中，Pembrolizumab、Nivolumab、Durvalumab和Atezolizumab单药治疗已被美国食品药品监督管理局(FDA)批用于晚期非小细胞肺癌的二线治疗,同时，Pembrolizumab被批准用于PD-L1高表达(肿瘤比例评分(TPS)≥50%)且无表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因突变的晚期非小细胞肺癌患者的一线单药治疗[6]。

PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗的疗效预测标志物

PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗总体客观缓解率较低。CheckMate-063[7]、CheckMate-017[8]和CheckMate-057试验[9]表明单用Nivolumab虽然与化疗相比能够提高晚期非小细胞肺癌治疗的客观缓解率，但均未超过20%。而Keynote-001试验[10]表明，单用Pembrolizumab总体客观缓解率也仅为27%。所以，如何提高ICIs治疗靶标人群的客观有效率是近年来研究热点。一些可以预测ICIs治疗疗效的标志物被陆续报道，如肿瘤PD-L1表达、循环肿瘤细胞及其细胞PD-L1的表达、肿瘤浸润性淋巴细胞、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性或肠道微生物群等，最新研究也发现IL-35和POLE基因在肿瘤免疫治疗疗效预测方面有着一定的作用。

一、肿瘤PD-L1表达

2015年FDA批准Pembrolizumab用于PD-L1表达≥50%的晚期非小细胞肺癌的一线治疗，但应用Nivolumab或Atezolizumab的疗效与PD-L1表达之间的关系还没有完全得到证实。 Patel等[11]总结发现PD-L1表达阳性的非小细胞肺癌患者接受免疫治疗有效率超过60%，而PD-L1表达阴性的患者治疗客观有效率很低。Keynote-001[10]、Keynote-010[12]和Impower-131[13]研究发现免疫治疗在PD-L1阳性表达的患者中显著获益。而CheckMate-026研究[14]发现Nivolumab并没有延长PD-L1表达≥50%的晚期非小细胞肺癌患者的总生存期和无进展生存期。以上不同研究结果导致PD-L1作为免疫治疗的疗效预测指标仍存在较大争议，其中的原因可能有[11]：(1)各临床研究关于PD-L1阳性表达的评判标准不同：在Keynote临床试验中，PD-L1表达≥50%为阳性表达，而在CheckMate-063和CheckMate-026试验中，PD-L1表达≥5%即为阳性表达；(2)检测肿瘤PD-L1表达的抗体和免疫组化方法均不同，因此得出的结论亦会有所差别；(3)肿瘤的异质性：由于PD-L1在肿瘤中的表达存在异质性，包括时间异质性及空间异质性，所以仅靠检测局部PD-L1的表达并不能准确评价肿瘤免疫微环境；(4)PD-L1的表达亦与EGFR和KRAS基因突变有关,并且化疗会影响PD-L1表达；(5)有研究表明，少部分PD-L1表达阴性的晚期非小细胞肺癌患者仍能从中获益，因此对于PD-L1表达是否和免疫治疗疗效一定呈正相关，存在争议[15]。因此，单独凭借PD-L1表达水平并不能较全面的预测免疫治疗预后。不过通过对PD-L1表达评估的标准化可能会进一步提高PD-L1的预测价值，目前常用的标准化指标有肿瘤比例评分(TPS，tumor proportion score)和联合阳性评分(CPS，combined positivity score)[16]。

二、循环肿瘤细胞及循环肿瘤细胞上PD-L1的表达(CTC及CTC-PD-L1)

近年来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell，CTC)及其细胞PD-L1的表达(CTC-PD-L1)可作为新的非侵入性的预测晚期非小细胞免疫治疗的长期动态监测标志物。CTC即为自发或因诊疗操作脱离原发灶或者转移灶进入外周血液循环的肿瘤细胞。在Frick等[17]人的研究中发现，CTC可以用来预测早期非小细胞肺癌患者接受立体定向放疗后的疗效，更高的基线CTC会增加肿瘤复发的风险。Castello等[18]人亦发现CTC是非小细胞肺癌患者免疫治疗无进展生存期及总生存期的独立预测指标，那么是否有可能将CTC作为放疗联合免疫治疗的预测标志物，这需要进一步的研究。Wang等[19]发现CTC-PD-L1表达阳性，是化疗预后不佳的独立预测因子，而化疗可以诱导CTC-PD-L1表达的上调，化疗联合免疫治疗可以增加抗肿瘤疗效，从而使更多的患者获益。但是，CTC及CTC-PD-L1是否可以准确预测免疫治疗联合放化疗的疗效，仍面临着极大的考验，这主要是有以下几点原因：(1)检出率低，不同检测试剂盒、检测数据库之间有显著差异；(2)CTC-PD-L1的检测，需充分考虑在接受免疫治疗前既往放化疗、靶向治疗等治疗史的影响；(3)检测成本高，耗费时间长。因此，虽然CTC及CTC-PD-L1相较肿瘤组织中PD-L1的表达检测更加安全并且可以动态观察，但是目前并不能取代其地位。

三、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)

肿瘤浸润的淋巴细胞(Tumor Infiltrates Lymphocytes，TIL)是一群异质性很强的细胞，其中一部分是抗肿瘤效应细胞，在非小细胞肺癌中，TIL数量与患者的预后直接相关[20]。TIL通过细胞毒作用和介导免疫反应，导致肿瘤细胞的凋亡。TIL引起肿瘤细胞凋亡的分子机制包括：(1)TIL激活后，其分泌的IFN-γ等细胞因子增多，可以诱导非特异性免疫反应；(2)TIL通过穿孔素和颗粒酶等直接靶向肿瘤细胞，促进靶细胞凋亡。有研究显示TIL数量可作为晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的预测指标[19]，但在临床试验中尚未得到进一步证实。

四、肿瘤突变负荷(TMB)

肿瘤突变负荷(Tumor Mutational Burden，TMB)是指肿瘤细胞编码基因突变的总和，包括碱基替换、基因插入、缺失错误等的总数[21]。肿瘤细胞编码基因的突变预示着肿瘤相关特异性抗原的产生，所以理论上突变越多，肿瘤新抗原(Neoantigen)产生越多，免疫治疗疗效越好。CheckMate-227等研究均证实高肿瘤突变负荷的患者从免疫治疗获益更多[22]。但是，肿瘤突变负荷作为免疫治疗生物标志物仍面临着极大的挑战，主要有以下几种原因：(1)肿瘤突变负荷因不同计算方法或检测基因的数量多少会导致不同的结果，目前主要用来检测肿瘤突变负荷的方法主要有FoundationOne CDx和MSK-IMPACT[23]；(2)肿瘤突变负荷阈值的判定在各研究中差别大。如CheckMate-026[14]研究中直接定义为突变数量(低突变负荷，<100 mutations；中等突变负荷100 to 242 mutations；高突变负荷>243 mutations)，而CheckMate-227[22]将肿瘤高突变负荷定义为肿瘤突变负荷≥10 mutations/Mb；(3)基因突变可能会干扰免疫治疗的效果；(4)重复肿瘤组织活检的局限性及危险性。近年来，关于测量血浆中的肿瘤突变负荷(bTMB)的phase Ⅱ POPLAR和phase Ⅲ OAK研究，显示基于血液的TMB检测可以预测Atezolizumab治疗非小细胞肺癌的无进展生存期[24],但是目前这一技术尚不成熟。最近，赵呈龙等[25]发现PD-L1≥50%且高肿瘤突变负荷组患者免疫治疗疗效最佳，虽然研究例数较少，不足以代表大数据，不过这可以提出是否将二者联合作为预测标志物的可能，更准确的筛选出获益人群。非小细胞肺癌特别是肺腺癌存在多种驱动基因的突变，而针对这类驱动基因突变的靶向治疗有明确疗效，目前的免疫治疗尚不能证明优于这类靶向治疗，因此是否可以将肿瘤突变负荷表达高低作为免疫治疗疗效预测标志物，仍需更多大样本研究。

五、微卫星不稳定性(MSI)

微卫星不稳定性(Microsatellite Instability，MSI)是基因组不稳定中的一种，主要特点是短的重复的DNA序列发生缺失或扩增等改变，常常导致基因发生移码突变。Hause等[26]发现多种肿瘤中存在微卫星高度不稳定性，且与患者预后相关。CheckMate 142[27]研究发现微卫星高度不稳定性结肠癌患者对PD-L1抑制剂具有较好的疗效。最近的分析发现多种肿瘤都可表现为微卫星不稳定，这提示是否可以将为卫星不稳定认为是广泛的肿瘤表型。不过也有研究表明微卫星高度不稳定在结直肠癌及胃腺癌中占比较高，而在肺癌中发生率较低[26]。此外，与其他免疫治疗生物标志物存在相同的问题，包括微卫星不稳定性的检测方法、划分阈值以及伴有其他基因突变是否会影响免疫治疗疗效，均存在争议。因此是否可将微卫星不稳定性作为晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的预测标志物仍有待研究。

六、肠道微生物群

肠道微生物在肿瘤发生及治疗中的作用近年来逐渐被认识。Obata等[28]发现肠道微生物可以通过调节T细胞分化成熟来影响肠道黏膜的免疫系统从而保持肠道免疫耐受。肠道微生物可以通过影响肠黏膜免疫进而调节人体免疫系统。而Routy等[29]发现将对免疫治疗反应率高的肠道微生物移植到无菌或经抗生素治疗后的小鼠体内能够改善其疗效，而临床数据提示接受抗生素治疗的患者无进展生存期及总生存率均较低，这可能是因为抗生素的使用扰乱了肠道菌群、抑制了晚期非小细胞肺癌患者的免疫检查点治疗，其中具体机制目前尚不明确。国内一项小样本研究[30]分析了37例患者肠道微生物的多样性，发现微生物多样性与PD-1单抗的疗效相关。但目前仍缺乏大样本、前瞻性研究证实这一结论。

七、其他

还有研究探索了其它一些与免疫治疗疗效相关的分子标记物，如体重指数(Body mass index，BMI)、中性粒细胞与淋巴细胞比值、基因表达标签(Gene expression profiles，GEPs)、POLE基因突变等，而EGFR等驱动基因突变阳性晚期非小细胞肺癌患者接受ICIs治疗疗效偏低[31]。但这些指标尚未得到大样本临床试验验证。

PD-1/PD-L1抑制剂联合放化疗疗效预测标志物

上述各个指标基本来自于ICIs单药治疗的临床数据，但目前更为急迫的是寻找能够指导PD-1/PD-L1抑制剂联合放化疗合理应用的标志物。

放化疗对肿瘤微环境具有调节作用。一方面，放疗可以通过直接或间接破坏肿瘤细胞DNA诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡，同时放疗可以上调肿瘤细胞表面的PD-L1表达水平并上调抗原递呈细胞MHC-I类分子和CD86的表达,同时小剂量的射线可以清除抑制性T淋巴细胞[32]。 另一方面，化疗对非小细胞肺癌细胞具有免疫调变作用并改善肿瘤微环境。化疗药物可诱导肿瘤细胞免疫原性的凋亡，通过“损伤相关分子模式”(damage-associated molecular patterns，DAMPs)启动免疫应答[33],同时化疗预处理可以清除免疫抑制性细胞并下调免疫抑制性细胞因子的表达形成促进免疫效应的微环境[34]。因此，尽管尚无直接的研究探索PD-1/PD-L1抑制剂联合放化疗的疗效预测标志物，我们认为可以动态监测肿瘤免疫微环境的指标，如监测肿瘤PD-L1表达、肿瘤浸润性淋巴细胞、肿瘤突变负荷等指标的动态变化,用以指导PD-1/PD-L1抑制剂和放化疗的联合应用。但动态监测肿瘤免疫微环境，需要对肿瘤进行再次活检，可喜的是，有临床研究报道这种再活检是相对安全的[35]。

结 论

ICIs已成为晚期非小细胞肺癌治疗的重要方法之一，但在临床应用中仍受到一定限制，疗效预测标志物的研发可以避免盲目的应用并提高治疗疗效。目前ICIs与常规放、化疗的联合应用显示出更广泛的应用前景，但目前尚缺乏深层次的理论基础来指导这种联合治疗模式的合理应用。本文初步总结了免疫检查点抑制剂联合常规放、化疗疗效可能的预测指标，以期为进一步的研究提供方向。