Moesin调控肺癌A549细胞增殖、侵袭的实验研究

张若琛 陈义坤 祝清清 张伟杰 黄建安

Moesin是ezrin-radixin-moesin (ERM)家族蛋白成员之一，它连接肌动蛋白细胞骨架和跨膜受体。ERM在不同物种之间高度保守[1]，其在调节细胞表面结构，如微绒毛和膜皱褶，以及特殊的膜结构域中起着关键作用[2-3]。ERM蛋白以单体或二聚体的形式存在于静止状态，可以通过磷脂或激酶介导的磷酸化诱导的构象变化来调节其功能，从而导致蛋白质的激活[4]。Moesin在多种癌症中表达上调，包括乳腺癌[5]、前列腺癌[6]、胰腺[7]、肺癌[8]和黑色素瘤[9]，并且其高表达与不良预后相关。

目前尚无关于Moesin对肺癌增殖转移作用的研究。本文旨在探索Moesin在非小细胞肺癌中的作用及其机制。

资料与方法

一、一般材料

1 细胞株 从中国科学院细胞库(上海)采购人NSCLC细胞A549、SPC-A1、HCC827、PC9、H1975(肺腺癌细胞系)、H226(肺鳞癌细胞系)H460(大细胞肺癌细胞)和BEAS-2B(人永生化正常上皮细胞)。

2 主要仪器 电泳仪(Bio-Rad)、显微镜(Olympus)、移液枪(Eppendorf)、超净工作台(中国苏净安泰公司)、二氧化碳培养箱(Thermo)、50 mL塑料培养瓶(Corning)、Transwell 小室(Corning)、24孔培养板(Corning)。

3 主要试剂 细胞培养基RPMI-1640(Hyclone)、胰酶(Cell Signal Technology)、无血清细胞冻存液(苏州新赛美生物科技有限公司)、蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Hyclone)、Anti-Moesin antibody(Abcam)、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康为试剂生物科技有限公司)、结晶紫(上海生工生物工程技术有限公司)、Cell Counting Kit-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

4 RNA干扰序列 si-RNA干扰序列如下：siMoesin-1：5′-GGAUCUUGGCCUUGUGCA UTT-3′, siMoesin-2： 5′-GGGCUGAUGCUAUGGCCAATT-3′。

二、方法

1 细胞培养 细胞在添加10%胎牛血清、1%双抗(青霉素和链霉素)和L-谷氨酰胺的RPMI-1640中，在标准细胞培养条件下(5%CO2/37℃)培养。

2 RNA干扰 在500 μL空白培养基中分别加入5 μL干扰序列及转染试剂lip2000，震荡离心后混匀，静置10 min。感染细胞后48 h后进行后续实验。

3 CCK-8法检测细胞增殖能力 在标准细胞培养条件下，以每孔3×103个细胞的浓度在96孔培养板中培养细胞。用CCK-8试剂盒在24、48和72 h后分别用酶标仪检测450nm和630nm的光密度值(OD值)。根据检测结果绘制生长曲线。

4 Transwell 在细胞迁移/侵袭实验中，分别接种3-6×104细胞于含有200 μL 1%培养基Transwell小室中，下室加入800 μL完全培养基。在标准细胞培养条件(5%CO2/37℃)下培养24 h后用甲醇固定30 min，1 mL结晶紫过夜染色，后用PBS清洗1～2遍。用显微镜拍照计数，放大倍数为200X。

三、统计分析

结 果

一、STARBASE、OSluca 数据库分析非小细胞肺癌患者中，Moesin高表达与不良预后相关(见图1)。

图1 Moesin高表达与非小细胞肺癌患者不良预后相关

二、Moesin在肺癌细胞系中的表达

用Western blot检测正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B以及8个肺癌细胞系中的moesin蛋白的表达(图2)。与正常细胞相比，moesin在肺癌细胞株中表达显著上调。选取表达量中等的A549进行后续实验。

图2 Moesin在肺癌细胞系中的表达

三、干扰Moesin可以抑制细胞转移

在A549细胞株中，通过Tranwell法检测显示，敲弱组的迁移以及侵袭能力明显降低，计数显示差距具有统计学意义(P<0.05)(图3A)。通过Western blot法检测干扰moesin后，EMT(上皮间充质转化)蛋白标志物的表达情况。可以看到，与对照组相比，干扰组Vimentin, N-cadherin表达均下调，E-cadherin,表达上调(图3B、C)。

图3 干扰Moesin对A549细胞转移及上皮间充质转移标志物的影响

四、干扰moesin可以抑制细胞增殖

在A549细胞株中，通过CCK-8法检测显示，敲弱组的增殖能力明显降低，计数显示差距具有统计学意义(P<0.05)(图4A)。通过Western blot法检测干扰moesin后，与增殖相关的蛋白标志物的表达情况。已有文献报道，AKT,ERK信号通路可以调剂肿瘤细胞增殖[10]。可以看到，与对照组相比，p-AKT, p-ERK表达均下调，而总蛋白并无明显变化(图4B、C)。

图4 干扰Moesin对A549细胞增殖及增殖标志物的影响

讨 论

本研究表明，Moesin在多种癌症中表达上调。

在非小细胞肺癌中，其高表达与肺癌患者分期及不良预后相关。并且，Moesin可促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。并且揭示其通过下游AKT, ERK, EMT信号通路从而影响细胞表型。

已有文献报道，在HCC827细胞株中，Moesin可以介导Snail诱导的EMT相关的P-糖蛋白活性的增加，从而增加对紫杉醇的耐药性。本研究已证实Moesin可通过EMT通路影响细胞转移。EMT是细胞从极化上皮表型向间充质成纤维细胞样表型转变的生物学过程[11]，它可以下调E-cadherin等上皮蛋白的表达，上调N-cadherin，Vinmentin等间充质蛋白的表达[12]。同时，EMT也是EGFR-TKI耐药机制之一[13-14]。这揭示Moesin蛋白在非小细胞肺癌的发生发展中具有重要意义。

在乳腺癌中，磷酸化Moesin与E3泛素连接酶SPOP竞争性结合PD-L1，从而稳定PD-L1蛋白[15]。近十年来，检查点阻断免疫治疗的发展取得了显著进展，特别是针对非小细胞肺癌PD-1和PD-L1的药物[16]。这给我们在非小细胞肺癌中，Moesin具体作用机制提供了研究的新思路。

Moesin的作用提示其可能与相关基因的靶向治疗存在潜在联系，其机制还需要我们进一步探索，助于我们找到癌症靶向治疗新的生物标志物。