捶打时间对牛肉凝胶品质的影响研究

孙 路，邹金浩，黄 群，杨怀谷，唐道邦, ，王旭苹

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

捶打牛肉丸是一种传统的牛肉凝胶制品，拥有广阔的市场前景[1]，其制作方法是人工利用特制铁锏或棍棒长时间捶打牛肉以破坏牛肉的肌肉组织，这类牛肉凝胶制品往往拥有优良的弹性和咀嚼口感，在市场上很受欢迎。但人工生产的产量低，品质不稳定使得其相比其他牛肉凝胶制品生产成本更高，利用电动捶打机可显著提高产品产量、稳定产品品质、降低生产成本，是一种良好的工业化生产模式。

牛肉凝胶制品在生产过程中有多个环节[2]，其中利用电动捶打机粉碎牛肉制备肉糜是捶打牛肉丸最重要的环节，在此环节中可能使肌原纤维蛋白结构变化、蛋白质改性[3]，康庄莉等在研究打浆工艺对肉丸的影响时发现打浆过程会使得蛋白质的β-折叠占比增加[4]，较高的β-折叠占比可改善肉丸的凝胶品质[5]。生产商也将捶打牛肉丸相比其他牛肉凝胶更吸引消费者的咀嚼口感归功于一定时间的捶打加工，但目前关于捶打时间与牛肉凝胶品质关联性的研究较少。

本文利用新鲜黄牛牛后腿肉为原料，以工业化加工肉丸打浆机制备的打浆工艺牛肉凝胶为对照（CK），用电动捶打机捶打不同时间制备捶打工艺为研究方法，分析不同捶打时间对牛肉凝胶品质变化的影响；并利用肉糜粒径、拉曼光谱变化及扫描电镜展示的凝胶微观结构变化，解释捶打时间影响凝胶品质的机理，以期为揭示传统捶打工艺加工牛肉丸时捶打对牛肉凝胶的品质变化影响规律提供理论参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄牛牛后腿肉 广州潼粤食品有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钠、2, 4二硝基苯肼（DNPH）、乙二胺四乙酸（EDTA）、尿素、三氯乙酸（TCA）、5, 5'-二硫代双（2- 硝基苯甲酸）（DTNB）、无水乙醇、乙酸乙酯、盐酸胍等 均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

CD 09型电动捶打机 长沙昌合机械有限公司；YF-RW 18型打浆机 顺德元芳食品机械有限公司；UV-1780紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；TA-XT. PLUS质构仪 英国Stable Micro Systems有限公司；WJL-628型激光粒度仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；S-3400N- Ⅱ型扫描电子显微镜 日立（中国）有限公司；Renishaw inVia显微共焦拉曼光谱仪 英国Renishaw公司。

1.2 牛肉糜及牛肉凝胶制备

将黄牛牛后腿肉去除可见筋膜，切为边长为2 cm的立方体，加入3%氯化钠，20%去离子水（以肉重计），取部分牛后腿肉利用打浆机以3000 r/min打浆5 min作为对照组，其余利用电动捶打机捶打（机器功率2.2 kW，捶打力200 kg，每分钟捶打120次），自捶打15 min起每间隔5 min取一次样，直到捶打40 min止，整个过程中若肉糜中心温度超过26 ℃则加入冰块降温。取一部分肉糜用于测定色差、蛋白质氧化指标、粒径和拉曼光谱，另一部分灌装入直径为20 mm的塑料肠衣中于80 ℃恒温水浴20 min，流水冷却至室温并置于4 ℃冰箱过夜，用于测定蒸煮损失率与脂肪渗出率、凝胶质构和扫描电镜。

1.3 指标测定

1.3.1 色差变化 用色差仪对10 mm厚度的生肉糜样品测定L*（亮度）值、a*（红度）值和b*（黄度）值，对每组至少6次重复测试，并用以下公式计算W（白度）。

式中：W表示肉糜白度；L*表示肉糜亮度；a*表示肉糜红度；b*表示肉糜黄度。

1.3.2 肌原纤维蛋白氧化程度 肌原纤维蛋白提取：称取25 g肉糜加入100 mL的僵直液（10 mmol/L磷酸钠，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，pH7.0），以10000 r/min均质30 s，重复3次；然后以4000 r/min离心，5 min后倾去上清液，所得沉淀再次加入100 mL僵直液，重复上述步骤3次。所得沉淀再加入100 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，以10000 r/min均质30 s，重复3次；然后以4000 r/min离心，5 min，再经两层纱布过滤以去除残留结蹄组织等，重复操作3次，收集所有滤液，用0.1 mol/L HCl调节pH为6.25后，以10000 r/min离心，5 min，弃去上清，收集膏状沉淀，即为肌原纤维蛋白，加入0.6 mol/L PBS溶液5~10 mL溶解沉淀，并于48 h内使用。

肌原纤维蛋白羰基含量测定：取1 mL蛋白质溶液，加入800 μL含2 g/L 2, 4-二硝基苯肼（DNPH）的2 mol/L HCl溶液，在25 ℃避光反应1 h，然后各加入1 mL 20%TCA，在4 ℃下以10000×g离心5 min，弃上清液。用1 mL乙酸乙酯-乙醇溶液（1:1, v/v）洗涤沉淀3次，加入3 mL含20 mmol/L磷酸钠的6 mol/L盐酸胍溶液，在37 ℃避光水浴30 min，在4 ℃下以10000×g离心5 min。于370 nm波长处测定上清液的吸光度值，每个处理组重复3次。

肌原纤维蛋白巯基含量测定：取1 mL蛋白质溶液，加入9 mL 0.05 mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（含有0.6 mol/L NaCl、6 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素），在4 ℃下以10000×g离心15 min；取上清液3 mL，加入0.04 mL 0.01 mol/L DTNB，在40 ℃水浴15 min。用0.05 mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（含有0.6 mol/L NaCl、6 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素）作为空白，在412 nm波长处测定吸光度，每个处理组重复3次。

肌原纤维蛋白表面疏水性测定：制备浓度为5 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液，取1 mL的蛋白溶液与200 μL浓度为1 mg/mL的溴酚蓝于室温下搅拌10 min，然后离心15 min（4 ℃，6000 r/min），取上清液稀释10倍后用紫外分光光度计在595 nm波长处测量吸光值，重复3次。溴酚蓝结合量用以下公式计算。

式中：A对照表示空白组吸光度，Abs；A样品表示样品组吸光度，Abs。

1.3.3 蒸煮损失率与脂肪渗出率 取约200 g的肉糜样品，精确称重记作W1，塞入塑料肠衣中，80 ℃水浴加热30 min，解开包装，待冷却晾干后，称重记作W2，每个处理组重复3次，用以下公式计算。

式中：c表示蒸煮损失率，%；W1表示肉糜样品重，g；W2表示冷却晾干后样品重，g。

取25 g肉糜放入50 ml离心管中，在4 ℃下500×g离心5 min去除肉糜中的气泡。封闭离心管，放入80 ℃水浴加热30 min。取出后使用纸巾擦干外面的水分，立即打开试管盖，在室温下放置50 min，利于汁液的吸收和释放。采用将渗出液在105 ℃烘干16 h的方法进行测定。烘干后剩余的物质为脂肪渗出物，即释放的脂肪重量和样品初始重量的百分比。每个处理组重复3次。

1.3.4 凝胶质构 测试前速度为2.0 mm/s，测试中速度为2.0 mm/s，测试后速度为5.0 mm/s，压缩比为50%，两次下压间隔时间5 s，触发类型为自动；每个处理组重复6次。

1.3.5 肉糜粒径 取10 g肉糜放入2~4 ℃的100 mL双蒸水中，使用T 25高速匀浆器3000 r/min匀浆15 s。使用粒径仪测定粒径，在测定的过程中使用粒径仪自带循环系统保证肉糜颗粒在双蒸水中分散均匀，每次测定将获得4个准确的测量值。结果使用D10、D50、D90、Dav进行分析。

1.3.6 拉曼光谱 使用单晶硅对拉曼光谱仪进行频率校正后，取适量生肉糜均匀的涂抹在载玻片中央，用50倍长焦距镜头将激光聚焦到样品上，功率100 mW，获取的拉曼光谱波段在400~3600 cm−1。测定条件：光栅600 g·mm−1，狭缝200 μm，获取速度为120 cm−1·min−1，分辨率为2 cm−1，积分时间为60 s。

1.3.7 扫描电镜 凝胶样品取厚度1 mm薄片，在2.5%的戊二醛溶液中固定24 h，使用pH为7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸泡10 min，再用pH为7.0，含有1.0%四氧化锇的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗5 h，再用pH为7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液清洗10 min，使用50%、70%、90%、95%、100%乙醇各浸泡10 min梯度脱水。临界点干燥后喷10 nm厚度的金，通过扫描电镜观察并拍照。

1.4 数据处理

利用DPS 7.55软件分析数据，进行方差分析和显著性检验，由P<0.05判定存在显著性差异；利用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 色差变化

色差变化可以较直观地反映出肉类的品质变化。如表1所示，CK的L*值和W值最高，a*值较低，这表明打浆工艺样品相比捶打工艺样品更加发白；捶打工艺样品的L*值和W值随加工时间延长呈明显上升的趋势，40 min时达到最高。a*值和b*值随加工时间延长呈先上升后下降的趋势，25 min时最高。这说明捶打工艺相比打浆工艺可使肉糜更加红润；捶打时间低于25 min时，捶打时间越长生肉糜色泽更加红润；捶打时间超过25 min后捶打时间越长，生肉糜就越显苍白，这与蛋白质的逐渐氧化有关。Nishad等研究亦表明，羊肉的蛋白质氧化会使得L*值升高，a*值下降[6]。随着牛肉肌肉组织被逐渐粉碎，肌红蛋白与充足的氧发生氧合反应，生成氧合肌红蛋白使得肉糜颜色更加红润[7]，在25 min内a*值和b*值开始上升。在25 min后a*值和b*值上升的原因与肌红蛋白铁离子的化学状态相关，当铁离子以二价状态存在时，肉糜呈鲜红色，当蛋白质构象改变、变性时二价铁离子被氧化为三价铁离子时，肉色变暗呈褐色失去红润的色泽[8]；以上结果表明，捶打加工会加剧生肉糜与空气中氧气的反应，引起肌红蛋白颜色的改变。

表1 捶打时间对牛肉糜色差影响Table 1 Effect of beating time on color difference of minced beef

2.2 肌原纤维蛋白质氧化程度

羰基与总巯基含量是反映蛋白质的氧化程度的标志[9]，蛋白质氧化程度与羰基含量呈正相关，与总巯基含量呈负相关[10]。由图1可知，除捶打15 min外，其他捶打时间总巯基含量低于CK组，超过25 min后，随加工时间的延长，总巯基含量显著下降（P<0.05），至40 min时，捶打工艺肌原纤维蛋白的总巯基含量从15 min时的48.53 nmol/mg蛋白减少至41.74 nmol/mg蛋白，下降了13.99%；同时除捶打15 min外，捶打工艺的羰基含量显著高于CK组（P<0.05），羰基含量在15 min时为0.1 nmol/mg蛋白，至40 min时增加至0.2 nmol/mg蛋白，增加了95.65%。羰基的增加与总巯基的减少都证明蛋白质氧化程度不断加深，符合原料肉在加工过程中氧化程度上升的趋势[11]。

图1 捶打时间对肌原纤维蛋白羰基与总巯基含量的影响Fig.1 Effects of beating time on carbonyl and total sulfhydryl content of myofibrillar protein

氧化能够引起蛋白质天然构象的改变，蛋白质构象与蛋白质的功能特性密切相关，表面疏水性的变化表明了蛋白质的构象变化[12]。如图2所示，15 min样品的溴酚蓝结合量最低，为60.56 μmol/g，低于对照组，但差异不显著（P>0.05），之后随着加工时间延长，溴酚蓝结合量升高，在超过30 min后有显著差异（P<0.05），至40 min时为88.92 μmol/g。溴酚蓝结合量的升高与肌原纤维蛋白氧化有关，捶打加工时间的延长造成肌原纤维蛋白氧化程度加深，使得肌原纤维蛋白构象改变，包埋在内部的疏水性残基暴露在表面与溴酚蓝结合，从而使溴酚蓝结合量升高。叶凤凌等[13]证明氧化可以改变蛋白质的构象结构，从而影响其表面疏水性。

图2 捶打时间对肌原纤维蛋白与溴酚蓝结合量的影响Fig.2 Effect of beating time on binding capacity of myofibrillar protein with bromophenol blue

2.3 蒸煮损失率与脂肪渗出率

蒸煮损失率可以反映肉制品的持水性[14]。如图3所示，捶打工艺样品从20 min起蒸煮损失率显著（P<0.05）低于打浆工艺对照组（CK），捶打样品在15 min时蒸煮损失率最大，为16.97%，这可能是因为在15 min时肌肉纤维组织未被充分破坏，盐溶性蛋白质含量较低导致。在30 min时损失率最小，为11.34%；30~40 min时凝胶的蒸煮损失率随加工时间延长而增大，在40 min时达到12.99%，但始终低于对照组的17.77%。蒸煮损失率的变化可以反映凝胶的品质变化，蒸煮损失率越高，表明凝胶的结构越松散，这对凝胶的质构特性越不利[15]。

图3 捶打时间对凝胶蒸煮损失率的影响Fig.3 Effect of beating time on gel cooking loss rate

脂肪渗出率的高低可以反映凝胶的乳化稳定性[16]。由图4可知，捶打工艺肉糜的脂肪渗出率明显低于打浆工艺的对照组，且肉糜的脂肪渗出率随着捶打时间的延长先降低后升高。在15~30 min时肉糜的脂肪渗出率不断降低，在30 min时降到最低，为0.63%；30~40 min时脂肪渗出率有显著回升（P<0.05），但仍显著低于15 min样品（P<0.05）。在所有不同捶打时间的处理组中，捶打30 min的样品具有最好的乳化稳定性，而打浆对照组具有最高的脂肪渗出率，这说明捶打工艺可明显减少肉糜的脂肪渗出率，提高乳化稳定性。

图4 捶打时间对凝胶脂肪渗出率影响Fig.4 Effect of beating time on gel fat exudation rate

2.4 凝胶质构

凝胶质构是凝胶品质最直接的体现，不同的捶打时间对凝胶品质影响显著，表2反映了捶打工艺牛肉凝胶质构特性的变化。随着捶打时间延长，样品的硬度、咀嚼性呈上升的趋势；弹性、内聚性、回复性呈先上升后下降的趋势，且捶打工艺样品的弹性、内聚性、回复性均优于打浆对照组。这说明捶打工艺生产的牛肉凝胶品质优于打浆工艺，且在30 min内捶打时间越长，凝胶品质越好，与Zhang等[17]发现的轻度氧化提高了肌原纤维蛋白胶凝特性结果类似，捶打时间超过30 min凝胶的内聚性与回复性显著（P<0.05）下降。捶打30 min的凝胶硬度与咀嚼性适中，弹性、内聚性与回复性最高，凝胶品质最为优良。结合蛋白质氧化程度继续加深、凝胶蒸煮损失率持续上升的结果可知，蛋白质的深度氧化、凝胶持水率的下降引起了凝胶品质的劣化；Xia等[18]在对猪肉凝胶的研究中同样得出了这一结论。

2.5 肉糜粒径

肉糜的粒径变化可以反映肉糜的粉碎程度[19]。由表3的Dav可知，从20 min开始，捶打工艺肉糜的肉糜颗粒显著（P<0.05）小于打浆对照组，且捶打时间越长，肉糜颗粒越小。同时，与打浆工艺肉糜相比，除捶打15 min外，捶打工艺肉糜的D10、D50、D90数值显著（P<0.05）减小。图5反映了打浆对照组和不同捶打时间肉糜的颗粒大小分布规律。其中打浆对照组和15、20、25 min组都显示出双峰分布，即一个主峰和一个肩峰。说明肉糜中有两种主要的肉糜颗粒，一种是主导地位，一种是从属地位；30、35、40 min是单峰分布，表明肉糜中只有一种主要的肉糜颗粒，这与高菲菲等[20]对猪肉糜研究中发现的随着加工时间延长，肉糜平均粒径逐渐变小、粒度分布范围渐变窄的结果类似。以上结果说明捶打时间越长，对肉糜的粉碎越彻底，肉糜颗粒会更加细腻均匀，这对肉糜凝胶品质有重要影响，可以提高肉糜凝胶的口感和均一性。

图5 捶打时间对肉糜粒径大小分布的影响Fig.5 Effect of beating time on size distribution of minced meat

表3 不同捶打时间肉糜粒径变化Table 3 Change of minced meat particle size at different beating time

2.6 拉曼光谱分析

拉曼光谱的频率与强度变化可以指示蛋白质二级结构发生的变化[21]。通过处理400~3600 cm−1范围内的拉曼光谱，可以分析出捶打时间对牛肉糜的蛋白质二级结构的影响。图6是不同捶打时间牛肉糜在400~3600 cm−1范围内的拉曼光谱，不同实验组在1665 cm−1附近的拉曼光谱条带为酰胺Ⅰ带的伸缩振动，包含肽键C=O和C-N的伸缩振动、Cα-CN的弯曲振动、N-H的面内弯曲振动，这些变化能够提供蛋白质二级结构的信息[22]。

图6 不同捶打时间牛肉糜的拉曼光谱Fig.6 Raman spectra of minced beef in different beating time

由图7可知，相比CK，捶打加工牛肉糜的α-螺旋所占百分比更低、β-折叠所占百分比更高。李鹏等在对鸡肉进行超声辅助变压揉滚后发现鸡肉蛋白质构象发生变化，α-螺旋含量降低，β-折叠含量增加[23]，说明加工可以促进α-螺旋结构解折叠形成β-折叠结构。β-折叠的含量与肉的保水性和凝胶性具有正相关性，是蛋白质聚集并形成良好凝胶结构的基础[24]；除去15 min因肉糜不够细腻不符合此规律外，其他组均符合此规律。捶打时间越长，β-转角占比越低、无规则卷曲占比越高，说明加工时间越长，对蛋白质二级结构影响越大。以上结果表明，捶打工艺可以改变肉糜中蛋白质的二级结构，在30 min以内，捶打时间越长对凝胶形成有利，超过30 min，捶打时间越长对形成良好凝胶结构不利。

图7 捶打时间对肉糜蛋白质二级结构百分含量的影响Fig.7 Effect of beating time on the percentage of protein secondary structure in minced meat

2.7 扫描电镜分析

Zhang等[25]对鸡肉凝胶的研究表明凝胶微观结构中的凝胶网络变化可以解释凝胶的品质变化，通过对不同捶打时间的牛肉凝胶进行SEM观察可得图8。由图8可知，不同捶打时间的牛肉凝胶微观结构有明显差异。CK显示了牛肉凝胶拥有的蜂窝状结构[26]；15 min显示有未粉碎的肌肉组织，证明由于捶打加工时间短牛肉糜粉碎并不彻底，20 min开始不再有未粉碎的肌肉组织，且显示出一定数量空洞的蜂窝状结构，证明捶打加工20 min可以完全粉碎牛肉的肌肉组织；25和30 min样品的空洞较小且分布均匀，证明其凝胶网络结构更加致密、均匀，结合蒸煮损失率和质构指标可知这种结构赋予了牛肉凝胶更加优良的持水性、弹性、内聚性和回复性；35 min和40 min的凝胶孔洞变大，网络结构开始变得松散，同时牛肉凝胶的持水性、弹性、内聚性和回复性都呈现下降趋势。曹云刚等在对苹果纤维对猪肉凝胶影响的研究发现凝胶网络结构疏松、孔隙变大是持水性与质构下降的原因[27]，这证明了劣化的凝胶网络结构是凝胶品质下降的直接原因。

图8 捶打时间对凝胶微观结构的影响Fig.8 Effect of beating time on the microstructure of gelatin

3 结论

不同捶打时间处理得到的牛肉凝胶品质的差异明显。通过分析不同锤打时间对牛肉凝胶的影响，并以打浆工艺对照组（CK）相比可知，随着捶打时间延长，牛肉肉糜逐渐失去红润的色泽，肌原纤维蛋白的氧化程度逐渐加深；凝胶蒸煮损失率与脂肪渗出率呈先下降后上升的趋势，质构特性中硬度与咀嚼性明显上升，弹性、内聚性、回复性先上升后下降，捶打时间在30 min以内，捶打时间越长，牛肉凝胶拥有更低的蒸煮损失率、脂肪渗出率与更佳的质构特性，捶打时间超过30 min后，捶打时间越长，凝胶品质下降越显著。

通过对捶打牛肉样品的粒径、拉曼光谱和凝胶电镜扫描分析可知，捶打加工时间越长，肉糜平均粒径越小、粒度分布范围越窄，更加细腻的肉糜可形成品质更加优异凝胶，这一趋势随捶打时间延长变化明显；但捶打时间过长，会使肉糜氧化程度加深，改变蛋白质二级结构，导致凝胶品质下降，这一趋势在超过30 min时更加明显；电镜扫描图像中发现，随着捶打时间延长，凝胶的三维网状结构从松散变为致密再变为松散，证实了牛肉凝胶品质的变化与捶打时间密不可分。试验结果通过研究不同捶打时间导致的肉糜与凝胶的理化性质差异，解释了凝胶品质变化的规律和原因，表明捶打加工方式中适度捶打能提高肉糜品质，过度捶打反而让肉糜品质劣变。