褪黑素对人胃癌细胞生长的影响

2022-01-19 03:03王日雄周瑞祥
福建医科大学学报 2021年5期
关键词:细胞培养细胞株培养液

王日雄, 宋 军, 刘 卉, 周瑞祥

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,表现为进展快、生存时间短、对常规化疗反应差、患者预后差[1]。2018年,全球共有100多万例胃癌病例,导致78.2万人死亡。提高胃癌患者的生存率是目前临床面临的主要挑战[2]。褪黑素是由松果腺分泌的吲哚胺类神经内分泌激素。研究表明,褪黑素通过促进肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制增殖、调节抗肿瘤免疫机制,对肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤均有明显的抑制作用[3-6]。本研究拟建立不同浓度及时间点褪黑素对不同分化状态的人胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901及AGS的干预模型,在氯化钴(CoCl2)模拟乏氧条件下及常氧条件下,采用CCK-8、ELISA等方法检测褪黑素对人胃癌细胞增殖活性及血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A, VEGF-A)的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 MGC-803、SGC-7901及AGS人胃癌细胞株由中国科学院上海生命科学研究院提供。

1.1.2 主要试剂 RPMI-1640培养基、胰酶和胎牛血清(美国Gibco公司);多聚赖氨酸、褪黑素与氯化钴(美国Sigma公司);CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所);VEGF ELISA试剂盒(美国R&D公司)。

1.1.3 仪器 超净工作台(上海力申科学仪器有限公司);CO2孵育箱(美国Eppendorf公司);微量移液器(美国Eppendorf公司);倒置荧光相差显微镜(TE 2000-s,日本Nikon公司);光学显微镜(XSP-C203,德国Olympus公司);酶标仪(Model 550,美国Lab-Line公司)。

1.2 方法

1.2.1 褪黑素制备 称取褪黑素(MW 232.2) 23.2 mg,用5 mL无水乙醇完全溶解,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,即成浓度0.02 mol/L母液,分装后-80 ℃冻存。使用时室温溶解后抽取500 μL母液,加入500 μL RPMI-1640培养基稀释(终浓度为0.01 mol/L)。

1.2.2 褪黑素对人胃癌细胞干预研究的最佳浓度 取长至80%~90%汇合度的人胃癌细胞株MGC-803、SGC-7901及AGS,胰酶消化后按每孔5×103个细胞的密度分别接种于96孔板,每孔200 μL细胞培养液,18~20 h给予0.01、0.1、1及3 mmol/L不同浓度褪黑素干预,并设空白对照孔。分别在用药0.5、2、16、24 h后吸弃培养液,每孔加入含10 μL CCK-8溶液的新鲜培养液100 μL,37 ℃细胞培养箱内继续孵育1 h,用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)。每个浓度设6复孔,去除最高值和最低值后取平均值,实验重复3次。按下列公式计算细胞增殖抑制率:

细胞增殖抑制率=(各加药孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(对照组吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100%

以抑制率和给药时间为纵横坐标绘制曲线。

1.2.3 光学显微镜观察 将长至80%~90%汇合度的人胃癌细胞株SGC-7901以0.25%胰酶及0.1% EDTA进行消化,按每孔1×106个细胞的密度接种至6孔细胞培养板中。18~20 h(平皿中细胞80%~90%汇合),用0.01、0.1、1、3 mmol/L不同浓度的褪黑素干预,并设空白对照组,24 h后置光学显微镜下观察并拍照。

1.2.4 CoCl2模拟乏氧条件下褪黑素对SGC-7901细胞生物学行为影响 取常氧条件下及100 μmol/L CoCl2模拟乏氧条件下对数生长期SGC-7901细胞,按每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板,每孔 200 μL的细胞培养液,18~20 h给予 3 mmol/L褪黑素干预,并设空白对照孔,37 ℃细胞培养箱内继续孵育。24 h后吸弃培养液,每孔加入含10 μL CCK-8溶液的新鲜培养液100 μL,37 ℃细胞培养箱内继续孵育1 h,450 nm处测定OD。每种浓度设6复孔,去除最高值和最低值后取平均值,实验重复3次。

1.2.5 细胞分组 将常氧条件下及 100 μmol/L CoCl2模拟乏氧条件下处于对数生长期的人胃癌细胞株SGC-7901传代后制成单细胞悬液,以每孔1×106的密度分别接种于6孔细胞培养板中,于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱常规培养,18~20 h 给予褪黑素干预,分组如下:空白对照组及0.01、0.1、1、3 mmol/L MLT组,每种浓度设3个复孔,培养24 h。

1.2.6 ELISA检测人胃癌细胞SGC-7901培养上清液VEGF-A蛋白的变化 将所有试剂室温下平衡20 min,将待测的人胃癌细胞SGC-7901培养上清液10 000 r/min离心10 min后去除沉淀,建立标准曲线。加入待测样品后,37 ℃恒温箱反应 120 min,甩去板中样品,拍干并加满洗涤液,放置15~20 s后甩去,拍干,共洗5次。加入第一抗体工作液100 μL,37 ℃ 静置60 min。加入亲和链酶素-HRP,37 ℃ 静置30 min。加显色液A 50 μL,后加显色液B 50 μL,放进37 ℃恒温箱,避光显色10 min。加入终止液50 μL,混匀,在 492 nm波长处测定各孔的OD值。采用酶标软件Curve Expert 1.3绘制标准曲线,计算样本中VEGF的含量。

2 结 果

2.1 褪黑素对人胃癌细胞增殖的抑制作用 1 mmol/L褪黑素作用0.5、2、16及24 h,细胞增殖活性成线性下降;3 mmol/L浓度组褪黑素作用24 h后,人胃癌细胞活性低,而0.01及0.1 mmol/L浓度组褪黑素对MGC-803、SGC-7901及AGS人胃癌细胞无明显抑制增殖作用(图1),后继实验选择3 mmol/L、24 h作为褪黑素的最佳作用浓度及药物作用时间。

图1 不同浓度和不同时间点褪黑素干预对MGC-803、SGC-7901及AGS细胞增殖的影响Fig.1 Effect of melatonin on MGC-803,SGC-7901,AGS cell proliferation in different concentrations and time points

2.2 乏氧条件褪黑素干预后SGC-7901胃癌细胞的形态学改变 1 mmol/L浓度褪黑素干预后,SGC-7901细胞数量明显减少;3 mmol/L浓度褪黑素干预后,SGC-7901细胞不仅数量减少,且细胞触角开始缩短,细胞变圆,部分细胞飘浮(图2)。

A:0 mmol/L+乏氧;B:1 mmol/L+乏氧;C:3 mmol/L+乏氧。图2 乏氧条件下1、3 mmol/L褪黑素干预后SGC-7901胃癌细胞的形态学改变( ×200)Fig.2 Morphological changes of SGC-7901 gastric cancer cell after intervention with 1 mmol/L and 3 mmol/L melatonin in the normoxic condition( ×200)

2.3 乏氧条件下褪黑素干预对SGC-7901细胞生物学行为的影响 100 μmol/L CoCl2模拟乏氧条件下,0.5、2、16及24 h后细胞增殖活性成线性上升,3 mmol/L浓度褪黑素作用24 h后,无论常氧及乏氧条件下SGC-7901细胞增殖活性均成线性下降,且细胞活性很低(图3)。

与0.5 h比较,☆:P<0.05,☆☆:P<0.05。图3 氯化钴模拟乏氧条件下褪黑素对SGC-7901细胞增殖的影响Fig.3 Effect of melatonin on SGC-7901 cell proliferation in the hypoxic condition simulated by cobalt chloride

2.4 褪黑素对SGC-7901细胞上清液VEGF-A浓度的影响 与空白对照组比较,常氧与乏氧条件下使用3 mmol/L 褪黑素处理24 h后,SGC-7901细胞上清液VEGF-A蛋白表达显著下调,差别有统计学意义(P<0.05);而缺氧条件下VEGF-A下降更为明显(图4)。

VEGF-A:血管内皮生长因子-A。与对照组比较,☆:P<0.05,☆☆:P<0.05。图4 褪黑素对SGC-7901细胞VEGF-A分泌的影响Fig.4 Effect of melatonin on VEGF-A secretion from SGC-790 cells

3 讨 论

研究证实,褪黑素由于具有强大的免疫调节功能、抗增殖效应、抗氧化和抗血管新生效应[7-9],褪黑素体外能够抑制多种肿瘤细胞株增殖,如乳腺癌细胞株、卵巢癌细胞株、肝细胞癌株、结肠癌细胞株、前列腺癌细胞株等[10-12]。本研究结果发现,低浓度褪黑素(0.01、0.1 mmol/L)对人胃癌细胞株MGC-803、SGC7901及AGS无明显抑制作用,而高浓度褪黑素(1、3 mmol/L)能明显抑制人胃癌细胞株的增殖,且呈时间和剂量依赖趋势。3 mmol/L褪黑素在体外抑制人胃癌细胞增殖作用最为显著。

恶性肿瘤生长过程中,当肿瘤直径超过1 mmol/L时,原有的血管已经不能满足肿瘤自身生长的需要,必须通过新生的微血管提供氧和营养物质。而新生的血管扩张、内皮细胞和基底膜的完整性,影响氧和营养物质的运输,形成慢性弥散障碍的低氧环境[13]。肿瘤血管形态学的改变也造成血管痉挛,造成急性或慢性灌注不足性低氧。因此,缺氧是实体瘤微环境的基本特征之一[14],在体外制造微缺氧的细胞培养环境,对研究微缺氧对肿瘤细胞生长的影响及微缺氧状态下药物对肿瘤细胞的作用具有重要意义。通常通过注入低氧气体来实现体外微缺氧细胞培养模型,但较为烦琐。研究证实,低氧环境可由CoCl2模拟[15-16]。本研究采用100 μmol/L浓度CoCl2模拟胃癌细胞的缺氧环境。CCK-8检测结果显示,SGC-7901胃癌细胞的增殖活性明显增强,表明胃癌细胞在缺氧时启动了低氧适应机制,产生了特殊的细胞增殖现象,但应用3 mmol/L褪黑素干预可明显抑制SGC-7901细胞的增殖,其对细胞的毒性作用呈时间-剂量依赖性。

血管生成是胃癌发生、发展的前提[17],肿瘤细胞分泌的VEGF、肝细胞生长因子、表皮生长因子和转化生长因子、血小板衍生因子、白细胞介素、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、胎盘生长因子等多种促血管生长因子中,VEGF是最有效的促血管生长因子,共通过与其靶细胞表面的VEGFR结合刺激血管内皮细胞增殖促进肿瘤微血管的生长[18-19]。研究发现,癌细胞系存在VEGF的自分泌信号,癌细胞自分泌产生的VEGF与自身受体VEGFR结合,使之发生磷酸化,促进癌细胞自身生长和维持细胞系侵袭表型,这一作用可能独立于其促血管生成的旁分泌作用。这些结果均表明,癌细胞存在VEGF的自分泌信号,且通过VEGF/VEGFR自分泌环调节肿瘤细胞增殖、侵袭与凋亡[17,20-22]。笔者检测了褪黑素对人胃癌SGC-7901细胞及细胞上清液VEGF-A蛋白表达的影响,结果发现,褪黑素干预可抑制SGC-7901细胞中VEGF-A蛋白的分泌,并呈剂量依赖性。因此,笔者认为,抑制人胃癌细胞SGC-7901 VEGF-A的自分泌作用可能是褪黑素抑制SGC-7901细胞增殖作用的机制之一。

猜你喜欢
细胞培养细胞株培养液
2-脱氧葡萄糖联合奥希替尼对非小细胞肺癌细胞株H1975耐药性、糖酵解水平表达和增殖活性的影响*
从一道试题再说血细胞计数板的使用
几种培养液对水螅种群增长影响探究
miR—122调控LAMC1表达与肝癌细胞迁移侵袭相关性研究
骨髓基质细胞自体移植兔坐骨神经的研究
2015~2016年菏泽市流行性感冒病毒分离鉴定结果分析
细胞培养在生物制药领域的应用
超级培养液