Pan-TRK免疫组化染色方法比较分析

沈 萍，陈洁枫，金晓婷，殷敏智

WHO(2020)软组织和骨肿瘤分类介绍了一类新肿瘤，称为神经营养性-原肌球蛋白受体酪氨酸激酶基因(neurotrophic tropomyosin-tyrosine receptor kinase, NTRK)重排梭形细胞肿瘤(NTRK-rearranged spindle cell neoplasm)[1]。该类肿瘤好发于儿童及青少年，组织学表现多变，预后不同，但均存在NTRK基因易位，通过靶向药物治疗可获得较好的疗效。文献报道通过免疫组化检测Pan-TRK抗体可以对此类病变起到很好的筛查作用[2-3]。本实验应用两种全自动免疫组化仪染色及手工染色检测Pan-TRK，并对结果进行比较，以期寻找最佳的染色方法。

1 材料与方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心存档的7例手术切除标本。其中5例分子检测证实存在NTRK基因易位，符合NTRK重排梭形细胞肿瘤的诊断。另2例为婴儿型纤维肉瘤切除标本，证实均存在ETV6-NTRK3融合基因。

1.2 仪器设备与试剂全自动免疫组化仪为美国罗氏公司的Benchmark Ultra和德国徕卡公司的BOND MAX。一抗Pan-TRK(ERP17341，ab181560)购自Abcam公司。全自动免疫组化仪使用的二抗及显色系统、苏木精复染液等均为相应仪器自带套装。手工染色使用试剂：抗原修复液(GT100411)、二抗(GK600711)、显色剂(GK347011-A/B)、过氧化物酶阻断剂(GT100535)，均购自上海基因生物公司。

1.3 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，65 ℃烤箱烤片2 h。(1)美国罗氏公司的Ultra全自动免疫组化染色仪，使用OptiView程序，Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修复液99 ℃修复72 min；抑制剂封闭15 min；一抗37 ℃孵育30 min；二抗室温孵育12 min；DAB显色12 min；苏木精Ⅱ复染8 min；返蓝液返蓝4 min。(2)徕卡BOND MAX全自动免疫组化染色仪，使用ER Ⅱ抗原修复液(pH 9.0)99 ℃修复72 min；抑制剂封闭15 min；一抗室温30 min；二抗室温15min；DAB显色10 min；苏木复染5 min。(3)手工染色法采用EnVision法，免疫组化修复液(pH 9.0)直接煮沸修复72 min；内源性过氧化物酶阻断剂封闭10 min；一抗室温孵育1 h；二抗室温孵育15 min；DAB显色5 min，苏木精复染1 min。

2 结果

2.1 7例NTRK基因易位情况及三种染色方法结果NTRK重排梭形细胞肿瘤和婴儿型纤维肉瘤不同的易位基因及不同的染色方法结果略有区别(表1)。

表1 7例NTRK基因易位情况及三种染色方法结果

2.2 三种染色方法结果对比分析本组结果显示，在出现NTRK1基因易位的病例中(例1、3、4、5)，三种方法均可得到阳性结果。两种全自动免疫组化仪染色阳性信号强，定位清晰，背景干净(图1、2)，其中徕卡设备染色阳性更强；手工染色以表达、定位及背景着色均尚可(图3)。出现NTRK3基因易位的病例中(例2、6、7)，包括2例婴儿型纤维肉瘤，罗氏全自动染色65%～75%肿瘤细胞阳性，定位清晰，背景干净(图4)；徕卡和手工操作均未得到阳性结果(图5、6)。

3 讨论

NTRK包括NTRK1(1q21-22)、NTRK2(9q22)和NTRK3(15q25)[4]。在WHO(2020)软组织和骨肿瘤分类中将出现NTRK基因改变的肿瘤均归为NTRK重排梭形细胞肿瘤(不包括先天性/婴儿型纤维肉瘤)。目前已有的靶向药物均疗效明显，如Larotrectinib、克唑替尼等，尤其针对复发、转移患者[5-6]，因此明确病理诊断意义重大。

NTRK重排梭形细胞肿瘤是一组临床及病理异质性高的罕见肿瘤。其共同点均具有NTRK基因改变，好发于儿童及青少年。该病变发生部位广泛，组织学表现多样，一般表现为梭形细胞肿瘤，但也可上皮样/横纹肌样，浸润性生长，伴有黏液变、不同程度炎细胞浸润，核分裂多少不等[7]。由于其病变部位广泛，组织学表现多变，给病理诊断带来了巨大挑战，亟需寻找合适的辅助技术来协助诊断。

用于NTRK融合基因检测的技术包括免疫组化、FISH、RT-PCR、新一代测序等。诊断的金标准是在分子水平进行基因检测[8]。考虑到此类肿瘤涉及不同的3条染色体的相应区域，如对可疑病例采用病理科较常开展的分子检测手段(如FISH)，需要使用3个探针才能明确，无论是医疗资源、还是社会资源均是极大的浪费。免疫组化技术的优点在于省时省力省钱，在国内大部分病理科已经常规开展。目前针对TrkA/B/C蛋白的抗体主要有抗TrkA单克隆抗体(EP1058Y，Abcam公司)和Pan-TRK单克隆抗体(ERP17341，ab181560，Abcam公司)。文献报道Pan-TRK具有高度的灵敏度和特异性[9]；同时不同的Pan-TRK表达模式提示涉及的基因不同：胞质阳性提示可能涉及NTRK1/2，胞核(可伴有胞质)阳性可能涉及NTRK3，可根据免疫组化结果作为后续分子检测的依据。因此，Pan-TRK免疫组化染色可作为有效的辅助诊断和筛查工具[8]。

来自Nordi相关资料提示：同一抗体在不同设备或使用不同的流程染色，其结果差异较大，阳性率高者达95%，低者仅11%[10]。本组通过三种不同的染色方式以寻找Pan-TRK合适的染色方法，分别是罗氏和徕卡全自动免疫组化仪染色及手工EnVision法染色。按照说明书推荐结合本实验室摸索的条件，试剂的工作浓度为1 ∶150。

本组结果显示，在出现NTRK1基因易位的病例中，三种方法均可得到阳性结果，全自动染色仪得到的结果略优于手工方法。出现NTRK3基因易位的病例(包括2例先天性纤维肉瘤病例)，罗氏全自动染色65%～75%肿瘤细胞阳性，定位清晰，背景干净；而徕卡全自动染色和手工染色均未得到阳性结果。造成的原因可能为：(1)修复条件不同：本试验罗氏全自动免疫组化仪使用的是仪器自带的抗原修复液(pH 8.4)，设置修复时间达72 min。长时间的修复充分暴露了抗原，便于更多的抗体结合。手工方式尝试采用不同修复时间包括30 min、72 min修复，使用两种不同pH值(pH 9.0和8.4)修复液进行试验，均得不到较为理想的阳性结果，整个修复过程中始终在关注修复液的量及pH变化。可能与手工操作、抗原暴露不够充分有关。徕卡全自动免疫组化仪使用的是仪器自带的抗原修复液(pH 9.0)，修复时间从最初的20 min延长到72 min，未得到阳性结果，背景变得更深，最终结果无法判读。日常工作中，徕卡设备抗原修复一般为20～30 min，建议不超过50 min，此次延长到72 min，仅是出现背景加深。可能长时间的抗原修复并不是设备理想的工作状态。(2)DAB染色液的作用原理不同：罗氏的OptiView DAB染色液对比普通的DAB试剂盒中间多加了一种带有酶的三抗，其与二抗结合直接作用于携带有相应底物色原体系统的一抗，这种结合有助于催化DAB显色。徕卡全自动染色和手工染色所用的DAB均无此作用。上述这些区别可能导致结果的差异。

因此，如果考虑NTRK重排梭形细胞肿瘤，尽量选择罗氏全自动免疫组化染色仪进行免疫组化染色。建议每次检测均设置阳性对照。另外，对每批号的抗体需要进行性能验证，以保证结果的准确性，试剂应在其有效期内使用。

随着分子检测手段的普及，越来越多的疾病均被发现存在特异的基因学改变，而靶向药物的出现让临床医师对病理诊断的要求也越来越高。虽然现在越来越多的病理科已开展了分子检测技术，但免疫组化技术开展时间长，开展的科室广，抗体种类多，检测时间短等具有其不可替代的优势。对于免疫组化的开展，前期结合实验室具体情况制定最佳的操作方法，实验过程中选择合理的内、外部对照，以及实验后定期的质控都是缺一不可的重要环节。