前列腺癌中PCDH9表达缺失在抑制细胞凋亡、促进肿瘤进展中的作用

龙琼先，伍 季，彭 勇，张旭乾，廖文华

国际癌症研究中心(IARC)的GLOBOCAN数据库显示，2020年前列腺癌新发病例1 414 259例，死亡病例375 304例，是全球第四大常见癌症和男性第二大常见癌症[1]。原钙黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)属于非聚集型原钙黏蛋白家族，与已证实的抑癌基因PCDH8、PCDH17、PCDH20同位于染色体13q21，可介导细胞间的黏附作用，以及调节多种效应分子，其表达缺失可引起肿瘤增殖甚至转移[2]。现有研究显示，PCDH9在多种实体肿瘤(如胶质细胞瘤、胃癌、肝癌)组织中表达下降，且与肿瘤恶性程度及患者预后密切相关。一项研究对65例未经治疗的中国前列腺癌患者及良性配对组织进行了全基因组和转录组测序，发现前列腺癌组织中存在PCDH9缺失，其可以作为一个新的潜在的前列腺癌抑制基因[3]。然而，PCDH9缺失对抑制前列腺癌细胞凋亡、促进肿瘤细胞浸润和转移的影响报道甚少，其在前列腺癌发生、发展中的作用机制仍不清楚。本实验分析PCDH9在调控前列腺癌细胞周期中的作用，探讨其表达缺失在抑制前列腺癌细胞凋亡、促进浸润和转移中的分子机制，为明确前列腺癌的发生、发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018～2020年南充市中心医院存档的92例前列腺癌、36例良性前列腺石蜡包埋组织，所有组织常规HE染色后均经2位以上病理专家诊断。92例前列腺癌患者年龄48～87岁，平均(64.33±5.46)岁。按照2016版前列腺癌WHO/ISUP分级分组系统将前列腺癌分为1～5个组别：1组8例，2组15例，3组17例，4组21例，5组31例。术前PSA≤20 ng/mL 23例，>20 ng/mL 69例。所有患者均行手术切除治疗，患者术前均未行放、化疗或抗雄激素等治疗。

1.2 主要试剂PCDH9兔抗人抗体购自Abcam公司，STAT3、Cyclin D1和C-myc抗体均购自福州迈新公司；免疫组化检测试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新公司。

1.3 免疫组化取石蜡包埋组织蜡块3 μm厚连续切片，常规脱蜡至水。Multimer标记两步法检测，由全自动多功能病理检测系统(Benchmark GX，罗氏公司)按步骤操作。基本条件设定为：抗原修复30 min，用缓冲液冲洗，加入UV DAB inhibitor(Ultraview Universal DAB Detection Kit，罗氏公司)，37 ℃ 4 min。缓冲液冲洗，添加一抗(PCDH9、Cyclin D1和C-myc)，37 ℃ 30 min。缓冲液冲洗，加UV HRP multimer(Ultraview Universal DAB Detection Kit，罗氏公司)，37 ℃ 8 min。缓冲液冲洗，加入等体积的DAB和DAB H2O2(Ultraview Universal DAB Detection Kit，罗氏公司)，37 ℃ 8 min。缓冲液冲洗，加入UV copper(DAB试剂盒内)，37 ℃ 4 min。缓冲液冲洗，苏木精Ⅱ核复染，37 ℃ 8 min。用缓冲液冲洗，加入Bluing Reagent，37 ℃ 4 min，缓冲液冲洗，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断组织切片由2名病理医师重复观察，随机选取5个高倍镜视野，按阳性细胞百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～25%为2分，26%～50%为3分，51%～100%为4分；按阳性染色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分相加作为最终评分：≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.5 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。样本率的比较应用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织和良性前列腺组织中PCDH9的表达PCDH9阳性呈棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位于细胞质。PCDH9蛋白在前列腺癌组织中低表达，阳性率为72.8%(67/92)，显著低于良性前列腺癌组织(100%)，差异有统计学意义(χ2=12.157，P<0.001)(图1A～C)。

2.2 前列腺癌组织中PCDH9与Cyclin D1、C-myc表达的相关性前列腺癌组织中细胞周期调控基因Cyclin D1的阳性率为68.5%(63/92)(图1D)，C-myc的阳性率为64.1%(59/92)(图1E)，与良性前列腺组织相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。63例Cyclin D1阳性前列腺癌组织中25例存在PCDH9蛋白表达缺失，25例PCDH9表达缺失病例中均存在C-myc蛋白过表达。同时Spearman检验分析前列腺癌组织中PCDH9表达与Cyclin D1、C-myc的表达呈负相关(r值分别为-0.414、-0.457，P<0.01)，差异有统计学意义(表1)。

表1 前列腺癌组织中PCDH9与Cyclin D1、C-myc表达的相关性

2.3 前列腺癌组织中PCDH9与STAT3表达的相关性STAT3阳性主要位于细胞核，其在前列腺癌组织中高表达，阳性率为82.6%(76/92)(图1F))，76例STAT3阳性的前列腺癌组织中24例存在PCDH9蛋白表达缺失，Spearman检验分析显示，前列腺癌组织中PCDH9的表达与STAT3的表达呈负相关(r=-0.216，P<0.05)，差异有统计学意义(表2)。

ABCDEF

表2 前列腺癌组织中PCDH9与STAT3表达的相关性

2.4 前列腺癌组织中PCDH9、STAT3表达与临床病理特征的关系分析前列腺癌组织中PCDH9、STAT3蛋白表达与临床病理特征的关系，发现在高WHO/ISUP分级分组、PSA>20 ng/mL及Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌组织中PCDH9的阳性率显著降低(P<0.01)，PCDH9表达与患者年龄、脉管神经侵犯无关(P>0.05)。前列腺癌组织中STAT3表达与WHO/ISUP分级分组、PSA水平相关(P<0.05)，在WHO/ISUP分级分组5组、PSA>20 ng/mL组中，STAT3的阳性率最高，而不同年龄、有无脉管神经侵犯及不同临床分期组间的表达差异无统计学意义(P>0.05，表3)。>

表3 前列腺癌组织中PCDH9、STAT3的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

近年来，中国男性前列腺癌的发病率逐渐升高，尤其是70岁以上的老年患者，严重影响了老年男性的生活及健康[4]。早期前列腺癌缺乏特异的临床症状，发病较为隐匿，临床上主要表现为尿频、尿急、夜尿增多、尿流细弱，与前列腺增生症状类似；当出现明显的症状时，疾病多已发展至中晚期[5]，易发生骨转移，临床上多数患者初诊时即失去了根治性治疗的机会。因此，探究中国前列腺癌的发生、发展机制，对前列腺癌的早预防、早诊断及早治疗具有重要的意义。

PCDH9属于非集簇原钙黏蛋白家族，可介导细胞间的黏附作用和调节多种效应分子，其表达缺失可引起肿瘤增殖甚至转移[2]。Wang等[6]在胶质母细胞瘤中观察到PCDH9表达下调，而PCDH9的外源表达可以抑制肿瘤细胞的迁移。PCDH9可以通过激活GSK-3β信号并抑制转录因子Snail1的表达来抑制肝细胞肝癌细胞的上皮-间质转化和细胞迁移[7]。另有研究发现miR-200a-3p在卵巢癌中表达上调，过表达的miR-200a-3p通过靶向PCDH9促进卵巢癌细胞的增殖[8]。上述研究提示恶性肿瘤中存在PCDH9表达缺失，且与肿瘤细胞增殖密切相关。本实验发现前列腺癌组织中PCDH9的缺失率为27.2%，与良性前列腺组织相比，其表达下调差异有统计学意义。同时，PCDH9表达与前列腺癌的分级分组、临床分期和PSA水平等预后指标密切相关。Zhang等[9]检测了24例前列腺癌和对应正常组织中PCDH9的表达，结果亦发现前列腺癌组织中PCDH9的表达低于正常组织。究其肿瘤组织中PCDH9表达缺失的原因，有研究发现肝癌细胞中不仅存在PCDH9的杂合性缺失，而且还存在DNA甲基化[10]；而在胶质母细胞瘤中miR-215-5p可以通过结合其启动子和3′UTR来抑制PCDH9的表达[11]。除了miRNA靶向PCDH9 mRNA影响蛋白表达，蛋白-蛋白相互作用也可能造成PCDH9表达缺失。最近有研究显示前列腺癌细胞中PCDH9表达下调导致AKT磷酸化和活性增加，PCDH9在转录后受piR-001773和piR-017184调控，进一步揭示了前列腺癌中PCDH9表达下调的意义[9]。

上述研究结果显示，前列腺癌组织中存在PCDH9表达下调，但其在抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞浸润、转移中的具体作用机制仍不清楚。STAT3是一种特殊的转录因子，多种恶性肿瘤细胞中都存在异常信号转导和STAT3的异常激活[12-13]。STAT3表达上调可诱导肿瘤细胞的增殖，而其下调可以促进肿瘤细胞凋亡，其是激活多种生长因子或细胞因子信号通路上的关键点。目前，已鉴定出许多STAT3的靶基因，包括编码抗凋亡基因BCL-x和MCL-1，细胞周期调控基因Cyclin D1和C-myc，以及促血管发生因子VEGF。Cyclin D1基因的扩增、染色体重排或转录后调节均可导致其蛋白过表达而使细胞发生癌变，STAT3可能通过调节Cyclin D1的转录使细胞周期发生紊乱，进而导致细胞发生恶性转化[14]。同时，STAT3通过SH2结构域与Src结合，激活C-myc基因并上调Cyclin D1的表达，促进细胞进入细胞周期[15]。Cyclin D1在正常组织中表达量较少甚至不表达，在多数恶性肿瘤中过表达。Li等[16]研究发现，卵巢癌中Cyclin D1表达显著高于良性卵巢肿瘤，其表达与肿瘤分级、FIGO分期、T分期和淋巴结转移有关，且Cyclin D1阳性组的LVD计数高于Cyclin D1阴性组。C-myc已经被证明在多种人类癌症组织中呈高表达，并且与肿瘤的发生、发展有关[17]。当染色体易位或信号通路基因突变等情况发生时，C-myc会发生不依赖于生长因子刺激的扩增，导致不受控制的细胞增殖和肿瘤产生[18]。本实验进一步探讨了STAT3信号通路在介导前列腺癌中PCDH9表达缺失、抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤进展中的作用。本实验亦发现前列腺癌组织中Cyclin D1、C-myc的表达明显高于良性前列腺组织，且随肿瘤分级分组、临床分期的增高而增高，与前列腺癌患者的预后有着密切关系。PCDH9与Cyclin D1、C-myc表达的相关性分析结果显示，前列腺癌组织中PCDH9表达下调与细胞周期相关蛋白Cyclin D1和C-myc过表达密切相关，PCDH9表达缺失率随着Cyclin D1和C-myc过表达率增高而增高，PCDH9表达缺失病例常存在Cyclin D1和C-myc的过表达，提示前列腺癌组织中PCDH9表达缺失可能会引起肿瘤细胞周期紊乱，导致肿瘤细胞的失控性生长。为此，本实验继续观察了前列腺癌组织中STAT3的表达，并分析了PCDH9表达下调与STAT3表达上调的关系，结果显示PCDH9表达缺失病例中存在STAT3的过表达，进一步提示STAT3信号通路在介导前列腺癌中PCDH9表达缺失、抑制肿瘤细胞凋亡和促进肿瘤进展中具有重要的作用。

综上所述，本实验结果表明，在前列腺癌的发生、发展过程中可能存在PCDH9的表达缺失，其作用机制可能是STAT3信号通路介导，通过调节细胞周期蛋白，进而促进肿瘤细胞的增殖，PCDH9可能成为进展期前列腺癌治疗的一个潜在新靶点。