二维液相色谱同时检测特医食品中维生素A、E、D3含量

李 贻,贺 君,王晓洁,张德殿,孙 萌,王伟宇

(1.烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005;2.鲁东大学特医食品研究院,山东 烟台 264025;3.威海鲁东特殊医学用途配方食品研究院有限公司,山东 威海 264309)

特殊医学用途配方食品(Food for Special Medical Purposes),简称特医食品,是为了满足特殊人群营养需求的医用食品,一般分为全营养、特定全营养和非全营养三大类[1-2]。特医食品主要以蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和碳水化合物为营养指标[3],其中维生素A、E、D3是重要的营养素。各类特殊病人生理特点及对维生素的需求不同,产品中相应的维生素含量也有一定的差异[4-5],因此需要对特医食品中维生素A、E、D3进行准确测定。

目前维生素A、E、D3常用的检测方法有气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8-9]、分光光度法[10-11]、毛细管电泳法[12-13]以及微生物试剂盒等[14-15]。国标法中维生素A、E、D3含量不能同时被检测出;高效液相色谱可同时检测维生素A、E,但样品前处理繁琐;反向高效液相色谱可单独检测维生素D2、D3,但方法步骤复杂[16]。在线二维液相色谱法是一种新的检测方法[17],能同时检测出维生素A、E、D3含量[18-19],且具有灵敏度高、结果准确、同时检测等优点,适用于同时检测特医食品中维生素A、E、D3含量。本研究对该方法进行了优化,以达到更为高效、快速、方便的效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

维生素A标准品(纯度98.4%)、维生素α-E标准品(纯度98.6%)、维生素D3标准品(纯度99.6%) 德国Dr.E公司;特医食品 市售;甲醇、乙腈 色谱纯;抗坏血酸、BHT、无水硫酸钠、氢氧化钾、石油醚、乙醚、无水乙醇 分析纯。

1.2 仪器设备

1260 II 二维液相色谱(包括四元泵、自动进样器、在线过滤器、二元泵、六通阀、柱温箱、VWD紫外检测器、DAD紫外检测器), 美国安捷伦科技公司;HH数显恒温水浴锅,常州国宇仪器制造有限公司;MG-2200氮吹仪,上海爱朗仪器有限公司;ME-204分析天平,梅特勒-托利多公司;N-1300旋转蒸发仪,上海爱朗仪器有限公司;N-1500高速离心机,湖南湘仪仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制 氢氧化钾溶液(50 g/100 g):称取50 g氢氧化钾,加入50 mL水溶解,混匀备用。

维生素A标准储备液(0.5 mg/mL):准确称取维生素A标准品25.0 mg,用甲醇溶解后定容到50 mL容量瓶,得到维生素A标准储备液。维生素E标准储备液(1.0 mg/mL):准确称取α-维生素E标准品25.0 mg,用甲醇溶解后定容到25 mL 容量瓶,得到维生素E标准储备液。维生素D3标准储备液(0.1 mg/mL):准确称取维生素D3标准品10.0 mg,用甲醇溶解后定容到100 mL容量瓶,得到维生素D3标准储备液。

维生素A、E、D3混合标准溶液的配制:分别移取维生素A储备液2 mL,维生素E储备液10 mL,维生素D3储备液1 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到维生素A、E、D3混合标准储备液。准确移取10 mL维生素A、E、D3混合标准储备液到于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,此时得到维生素A、E、D3混合标准溶液(VA:1 μg/mL,VE:10 μg/mL,VD3:0.1 μg/mL)。

维生素A、E、D3混合工作溶液的配制:分别移取不同体积的维生素A、E、D3混合工作溶液于100 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成不同浓度的系列标准工作液。该系列中维生素A质量浓度为10、50、100、200、500 ng/mL,维生素E质量浓度为100、500、1000、2000、5000 ng/mL,维生素D3质量浓度为1、5、10、20、50 ng/mL。

1.3.2 样品前处理优化 称取5.0 g特医营养粉置于圆底烧瓶中,加入20 mL水将营养粉溶解并混匀,再加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT,混匀,加入30 mL的甲醇和10 mL的氢氧化钾溶液,混匀后于75 ℃恒温水浴锅中皂化35 min。将皂化后的溶液转移到100 mL具塞量筒中,加入15 mL乙醚和15 mL石油醚混合提取,然后吸取上层醚层溶液至蒸发瓶中,重复提取三次,合并醚层溶液,用水洗至中性,过5 g无水硫酸钠脱水后,用旋转蒸发仪蒸发,待溶液蒸发只剩2 mL左右时,立即用氮吹仪吹干,然后用10 mL甲醇溶液溶解残留物,混匀,取上清液并经过0.22 μm有机滤膜过滤,放入棕色小瓶,上机测试。由于前处理后的样品溶液中含有一定的杂质,因此在样品进入色谱柱之前加装一个在线过滤器,样品溶液经过在线过滤器能有效过滤杂质,然后进入色谱柱分析检测,以提高色谱柱使用期限,使样品检测结果更加准确。

1.3.3 二维液相色谱条件 一维条件:Agilent Poroshell 120 C18(2.6×100 mm,2.7 μm)色谱柱,流动相为水+甲醇,流速1 mL/min,梯度洗脱,VWD检测器进行检测(维生素A、维生素E),波长325 nm、296 nm,柱温35 ℃。

二维条件:Agilent Eclipse PAH(2.1×100 mm,3.5 μm)色谱柱,流动相为乙腈+甲醇,流速0.3 mL/min,梯度洗脱,DAD检测器进行检测(维生素D3),波长264 nm,柱温35 ℃。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2 结果与分析

2.1 线性关系

通过对相应浓度范围内的维生素A、E、D3混合标准工作液进行测定分析,结果如表2所示,维生素A、E、D3对应的线性方程相关系数r均在0.999 6以上,表明维生素A、E、D3在其对应的浓度范围内线性关系良好。图1为维生素A、E标准色谱图,图2为维生素D3标准色谱图。

表2 维生素A、E、D3线性方程与相关系数rTab.2 Vitamin A,E,D3 linear equation and correlation coefficient r

图1 维生素A、E标准色谱图Fig.1 Standard chromatogram of vitamin A and E

图2 维生素D3标准色谱图Fig.2 Standard chromatogram of vitamin D3

2.2 六通阀切换时间的确定

当做不切阀实验时,维生素A、E、D3标准溶液只经过一维色谱柱分离,六通阀一直处于位置1,如图3(a)所示,维生素A标准色谱峰出峰时间为5.003 min,维生素E标准色谱峰出峰时间为8.906 min,维生素D3标准色谱峰出峰时间在维生素A和维生素E之间,因此确定六通阀切换位置时间为5.95 min,VWD检测波长切换时间为7.02 min。

二维液相色谱仪通过六通阀控制所测溶液进入色谱柱的方式,一维色谱柱分离维生素A、E,二维色谱柱分离维生素D3,当六通阀处于位置1时,样品溶液先经过在线过滤器过滤,随后样品溶液中维生素A、E、D3经过一维色谱柱(Poroshell 120 C18)进行分离,VWD检测器进行检测,波长为325 nm,维生素A色谱峰在5.003 min时出现,由于维生素D3含量较低,一维色谱柱不易分离,在5.95 min时六通阀由位置1切换成位置2(图3(b)),维生素D3则转入二维色谱柱(Eclipse PAH)进行分离,DAD检测器对维生素D3进行检测,波长为264 nm,7.02 min时VWD检测波长从325 nm切换为296 nm,接着检测维生素E,最终仪器同时检测出维生素A、E、D3。

图3 六通阀位置Fig.3 Six-way valve position

2.3 精密度实验

选择维生素A、E、D3混合标准工作液,使用“1.3.3”项下色谱条件,然后用二维液相色谱自动进样器进样4针,体积为20 μL,进行重复性分析实验,结果如表3所示,重复进样4针后,得到维生素A、E、D3实际浓度值,计算平均值与RSD,RSD在0.29%～0.52%之间,证明该仪器方法精密度高,色谱柱分离效果稳定。

表3 重复性实验结果Tab.3 Repeatable experiment results

2.4 检出限与定量限

二维液相色谱检出限按照3倍基线噪音计算,当信噪比(S/N=3)时,基线噪音为0.005 mAU,样品峰高为0.015 mAU,对应样品质量浓度为0.001 μg/mL,因此检出限为1.5 μg/100g。当信噪比(S/N=10)时为定量限,定量限为5 μg/100g。

2.5 样品检测结果及加标回收率

选择所购买的特殊医学用途食品进行检测,样品取4个平行样进行试验,检测后计算维生素A、E、D3含量、加标回收率以及相对平均偏差,具体数值见表4。图4为特医食品中维生素维生素A、E色谱图,图5为特医食品中维生素D3色谱图,由图4、5可得,样品中维生素A、E、D3色谱峰与标准溶液色谱峰出峰时间基本一致,检测结果与样品实际值较为接近,平均加标回收率在87.62%以上,因此该检测方法能有效测定特医食品中维生素A、E、D3含量。

表4 样品检测与加标回收率实验结果Tab.4 Sample detection and spike recovery experiment results

图4 特医食品中维生素A、E色谱图Fig.4 Chromatograms of Vitamin A and E in Special Medical Food

图5 特医食品中维生素D3色谱图Fig.5 Chromatograms of Vitamin D3 in Special Medical Food

3 讨 论

GB 5009.82—2016[16]标准方法中维生素A、E可通过反向高效液相色谱法同时测定,维生素D则需要液相色谱或液质联用单独测定,本研究则建立了二维液相色谱同时测定特医食品中维生素A、E、D3方法,与国标方法相比,本方法不仅同时检测出食品中维生素A、E、D3含量,也减少了繁琐复杂的实验步骤,提高了检测效率。张艳海等[17]建立了在线二维液相色谱法同时检测维生素A、E、D3方法,实验中维生素D3在一维色谱柱的出现时间没有固定,每次实验前需要先确定维生素D3出现时间再确定切换阀时间,且切阀后三元泵压力会升高,而本方法通过重复性实验结果证明色谱柱分离效果和重复性较好,二元泵压力稳定,维生素D3在一维色谱柱的出现时间和六通阀切换时间固定。在赵玉富等[19]建立的二维液相色谱同时检测维生素A、E、D3方法中,使用石油醚对皂化后的样品溶液萃取2次以达到萃取目的,与之相比,本方法采用了石油醚+乙醚混合液对皂化后的样品溶液重复萃取3次,更能有效提取样品溶液中维生素A、E、D3。此外，上述几种方法中仪器都未安装在线过滤器,样品溶液中杂质容易造成色谱柱堵塞,使泵压力升高,而本实验加装的在线过滤器能有效去除样品溶液中杂质,可提高色谱柱稳定性和准确度。

4 结 论

本研究以特医食品为样品,对样品前处理过程进行优化,经过前处理的样品溶液通过二维液相色谱法同时检测维生素A、E、D3含量,实验结果显示维生素A、E、D3在相应浓度范围内线性良好,平均加标回收率在87.62%～103.10%之间,RSD在2.62%～8.26%之间,样品检测结果与实际值接近。该方法具有高效、快速、准确、灵敏度高以及同时检测等特点,不仅为同时检测特医食品中维生素A、E、D3提供方法参考,也为二维液相色谱同时检测多种维生素提供一定的技术借鉴。