阿托伐他汀对急性心肌梗死小鼠心肌组织赖安酰氧化酶表达的影响

刘会 庞军 谭洪文 田野 陈保林

(贵州省人民医院心内科，贵州 贵阳 550002)

近年来，急性心肌梗死(acute myocardial infarction,MI)发病率明显上升，成为全世界致死和致残的首要疾病，严重威胁人类健康。心肌梗死过程中，心肌细胞坏死、凋亡，导致心肌细胞锐减，非梗死区心肌细胞扩大、间质纤维化，心肌收缩力下降从而引起心功能不全。减少心肌细胞坏死、凋亡，抑制心肌纤维化意义重大。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)具有稳定细胞外基质免受基质金属蛋白酶降解的功能[1]，LOX表达量与心肌纤维化的程度相关[2]。目前有研究[3]表明，LOX参与冠心病等疾病的发生及发展。Xiao Y等复制猕猴心肌梗死模型，提取梗死区心肌组织测定LOX RNA和蛋白，梗死区心肌组织LOX表达较假手术组明显增加。目前的研究仅涉及LOX在急性心肌梗死模型中的表达情况，而药物是否可逆转急性心肌梗死心肌中LOX表达尚未见相关报道。基于上述，本实验旨在观察阿托伐他汀对急性心肌梗死小鼠心肌组织LOX表达的影响。报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 8周龄SPF级健康雄性C57BL/6小鼠45只 [合格证编号：SCXK(京)2006-000]置于室温22℃～25℃、相对湿度为45%左右的动物房内颗粒饲料(许可证号：SCXK-(粤)2008-0002)饲养，均自由饮水。随机选取30只制作急性心肌梗死模型，2%异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定在手术板上，沿左侧胸大肌外侧缘做1 cm皮肤切口，钝性分离胸肌，将蚊式血管钳插入左侧第4或第5肋间，迅速撑开肋间挤出心脏，用6-0丝线于左冠状动脉前降支处打结，根据左室前壁心肌颜色变化明确缺血是否成功，然后将心脏送回胸腔，缝合胸部皮肤切口之后将小鼠放回笼中(JONS法)[4]。心肌梗死模型小鼠分为2组，每组15只。MI组(予等量生理盐水灌胃)；治疗组(急性心肌梗死模型建立后予阿托伐他汀2 mg.kg-1.d-1灌胃)。另取15只健康雄性C57BL/6小鼠设为对照组。

1.2方法 (1)组织标本处理和左心室质量指数(LVMI)测定 4周末，2%异氟烷吸入麻醉小鼠，仰卧位固定在手术板上开胸取出完整的心脏，肝素盐水洗净心腔内残流血液，去除心外膜、右心室和左右心房，保留室间隔，用滤纸吸去多余的水份，OCT包埋后迅速冻于液氮中，冰冻切片机沿左室长轴将心肌组织切成7 μm的切片；部分心肌分成若干部分装于EP管中，其后冻存于液氮中检测RNA和蛋白质。(2)TUNEL染色：7 μm的心肌组织冰冻切片用4%的多聚甲醛溶液固定10 min后，PBS漂洗3次，TritonX100穿膜5 min，PBS漂洗3次，加入混合好的TUNEL染液在37℃下反应60 min，PBS漂洗3次，封片后在荧光显微镜下观察拍照，Image Pro软件计数TUNEL阳性细胞数。每个切面取5个视野进行计数，取其平均值。(3)实时荧光定量PCR法测定：参照试剂盒说明书提取冻存左心室心肌组织总RNA，紫外分光光度测定其260 nm和280 nm的吸光度值(A)，计算总RNA的纯度。A260/A280在1.9-2.1之间认为纯度符合要求。依据公式(RNA样品浓度=A260×40 μg/L×稀释倍数)计算RNA样本浓度，配制出50 μg/L 的20 μL RNA样本稀释液，取5 μL进行逆转录。采用Icyclery IQ real-time PCR仪检测LOX和MMP-2 mRNA表达水平。所有引物均参造Genebank提供的序列，由大连晨钰生物有限公司合成。β肌动蛋白(β-actin)上游引物：5’-TTGTGCCTCTGTGTCGCATCCT-3’，下游引物：5’-GCTGACTAGCAGTCACTGCTA-3’，扩增片段为154bp；LOX上游引物:5’- ATGGTCGCTCGCAGATGATCG -3’，下游引物：5’- AGCTGTGAGATCTTCTCTGGC -3’，扩增片段为246bp；MMP-2上游引物:5’- ATGTCTGCTGATCGTTCATCG -3’，下游引物：5’- ACGTGCGAGACTGAGT GTAGC -3’，扩增片段为348bp。反应条件为：预变性95 ℃×10 min，变性95 ℃×10 sec，退火/延伸60 ℃×45 sec，循环38次。(4)Western Blot法检测：参照试剂盒说明书提取小鼠左心室心肌组织全蛋白，测定蛋白浓度。取50 μg全蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白后转膜，15%脱脂牛奶室温下封闭60 min，将膜与特异性抗体在4 ℃结合过夜(β-actin：鼠抗单克隆抗体，1:2 000；LOX：羊抗人多克隆抗体，1:500；MMP-2：鼠抗单克隆抗体，1:500；)，次日PBST漂洗10 min×3次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二级抗体(β-actin：山羊抗小鼠，1:20 000；LOX：鼠抗羊，1:500； MMP-2：兔抗鼠，1:500；)室温下摇床上反应 60 min，PBST漂洗10 min×3次，加入ECL液，曝光、显影、定影，用Bandscan软件分析条带像素灰度值。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况比较 对照组15只小鼠全部存活，小鼠活泼；MI组存活13只；治疗组存活14只；MI组及治疗组小鼠活动较对照组稍差。解剖死亡小鼠发现心脏破裂、腹水。

2.2各组小鼠心肌组织TUNEL染色 TUNEL染色显示，对照组小鼠心肌细胞凋亡数为(6±3.0)/高倍镜视野，MI组小鼠梗死周边区细胞凋亡数为(18±7.0)/高倍镜视野(P<0.05)，治疗组小鼠梗死周边区细胞凋亡数为(12±5.0)/高倍镜视野，比MI组减少了33%(P<0.05)。见图1，表1。

注：a.对照组；b.MI组；c.治疗组。图1

表1 各组小鼠左心室心肌组织TUNEL染色

2.3各组小鼠左心室心肌组织LOX和MMP-2 mRNA表达 与对照组比较，MI组小鼠心肌组织LOX和MMP-2 mRNA表达明显增加(P<0.05)；与MI组比较，治疗组小鼠心肌组织LOX和MMP-2 mRNA表达明显下降(P<0.05)。见表2。

2.4各小鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2蛋白表达 与对照组比较，MI组小鼠心肌组织LOX、MMP-2蛋白表达明显增加(P<0.05)；与MI组比较，治疗组小鼠心肌组织LOX、MMP-2蛋白表达明显下调(P<0.05)。见表2、图2。

注：LOX：赖氨酰氧化酶；MMP-2：基质金属蛋白酶-2； 1：对照组；2：MI组；3：治疗组。图2 各组小鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2蛋白表达

表3 各组小鼠左心室心肌组织LOX、MMP-2蛋白表达

2.5小鼠左心室心肌组织LOX与MMP-2指标的关系 MI组小鼠梗死周边区域细胞凋亡数与左心室心肌组织LOX(r= 0.79，P= 0.03)、 MMP-2(r= 0.81，P= 0.02)表达均呈正相关。

3 讨 论

随着人口老年化的发展，心肌梗死发病率居高不下，心肌梗死后心肌细胞凋亡、心肌间质纤维化，最终导致心肌收缩力下降、心肌功能障碍、室性心律失常和心源性猝死[5]，梗死区及非梗死区心肌组织节段及心肌厚度均发生异常变化，心肌细胞凋亡及坏死进一步加重心肌纤维化[6]，因此，抑制心肌细胞凋亡及心肌纤维化有助于改善心功能及远期预后。目前研究表明，LOX参与冠心病等疾病的发生及发展。LOX在心肌重塑过程中发挥不可替代的作用。在瓣膜性心脏病心肌组织中，LOX表达增加促进血管紧张素-II介导的心肌组胶原纤维及弹性纤维增加，进一步促进心脏扩大及心功能不全[7]。制作主动脉瘘介导的容量负荷增加型心力衰竭小鼠模型，发现心肌组织LOX表达明显增加，而且LOX表达增加促进心肌组织胶原纤维表达及心肌纤维化[8]。此外有研究表明，心肌梗死动物模型心肌组织LOX表达明显上调，心肌梗死8周后，心肌组织胶原纤维明显增加，基质金属蛋白酶-1表达明显下调，金属蛋白酶抑制因子-1表达无明显变化[9]。复制猕猴心肌梗死模型，提取心肌组织RNA和蛋白，检测发现梗死区心肌组织LOX表达较假手术组明显增加，此外，心肌组织I型及III型胶原纤维也明显增加[3]。以上研究均表明，LOX在急性心肌梗死心肌组织中表达增加。我们的实验表明，MI组小鼠心肌组织LOX mRNA及蛋白表达显著升高，TUNEL染色发现，心肌细胞凋亡数也增加，与之前的研究结果一致。因此，对LOX的调节与干预在急性心肌梗死的治疗过程中具有非常重要的意义。

他汀类药物已经广泛应用于冠心病患者并取得明显效果，可改善心肌梗死后心室重塑[10]，然而他汀类药物的多效性是否可通过调节LOX表达而保护受损的心肌目前研究仍然较少。现有研究表明，阿托伐他汀可通过调节基质金属蛋白酶的表达变化而显著降低动脉粥样硬化兔心肌胶原蛋白的表达，从而缓解心肌纤维化[11]。既往我们的研究表明，阿托伐他汀可下调糖尿病心肌病小鼠心肌组织LOX mRNA及蛋白表达，从而发挥心肌保护作用[12]。此外，在慢性心力衰竭小鼠心肌组织中，他汀可通过调节 LOX-p38-MMP-9信号轴发挥心肌保护作用[13]。此外，有研究表明，结扎冠状动脉前降支复制急性心肌梗死小鼠模型，发现心肌梗死周边区域及梗死区域的心肌组织LOX RNA及蛋白质表达明显增加，梗死区域心肌组织纤维化明显增加，转化生长因子-β信号通路促进LOX表达增加从而促进促进心肌纤维化及心脏重塑，引起心脏扩大及心功能不全，加入LOX的特异性抑制剂β-氨基丙后心肌梗死区域的LOX表达下降，心肌纤维化减轻，心功能不全好转[14]。此外，TGF-β信号通路还可上调LOX的表达促进扩张型心肌病心肌组织的III型胶原纤维表达[15]。本实验研究发现，MI组小鼠梗死周边区域细胞凋亡数增加，心肌组织LOX、MMP-2 mRNA和蛋白表达明显上调；相关分析发现，MI组小鼠梗死周边区域细胞凋亡数与左心室心肌组织LOX和MMP-2表达呈正相关。故我们推测，MI小鼠左心室心肌组织MMP-2表达与LOX表达变化有关。应用阿托伐他汀干预MI小鼠后，梗死周边区域细胞凋亡数下降，心肌组织LOX、MMP-2 mRNA蛋白表达下降。阿托伐他汀可逆转急性心肌梗死小鼠心肌组织LOX表达，LOX可调节MI小鼠心肌组织MMP-2表达。阿托伐他汀是否可通过别的信号通路调节MMP-2表达，本研究未涉及。

综上所述，阿托伐他汀可下调急性心肌梗死小鼠心肌组织LOX表达。这可能是阿托伐他汀治疗急性心肌梗死又一依据。