舒尼替尼调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移与凋亡机制研究

李 凡，朴香花，马 越，段显亮

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011；2.吉林市中心医院，吉林 吉林 132011)

骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，其特征为增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织，好发于儿童与青少年，远处转移率较高，发病早期就容易发生肺部转移，5 a生存率很低，严重威胁着患者健康和生命[1-3].目前，手术切除结合辅助化疗仍是骨肉瘤的主要治疗手段，虽然患者的保肢率及存活率有所提高，但仍有部分患者治疗效果欠佳，出现了转移，预后不理想.因此，探讨骨肉瘤发病机制及治疗骨肉瘤的新方法对改善患者预后和延长生存期具有重要意义.

血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，VEGFR-TKI)可以逆转免疫疗法药物的局部微环境，增强肿瘤细胞的免疫原性[4]，其代表药物为舒尼替尼.舒尼替尼是目前最新的靶向治疗药物，也是双通道、多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，主要应用在骨肉瘤的治疗上.有研究[5-6]显示：舒尼替尼在多种肿瘤中均发挥着较好的抗癌作用.还有研究[7-8]显示：程序性死亡受体蛋白-1(PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂在转移性骨肉瘤中高表达，PD-L1分布在癌细胞表面，通过T细胞表面上的PD-1抑制T细胞免疫活性，可以帮助肿瘤细胞躲避免疫细胞攻击.本研究主要探讨可以增强肿瘤细胞免疫原性的药物舒尼替尼利用PD-1及其PD-L1抑制剂治疗转移性骨肉瘤的作用机制.

1 材料与方法

1.1 材 料

骨肉瘤KRIB、U2OS、143B、MG63.2、LM-7和SAOS-2细胞(美国生物标准品资源中心(ATCC)，美国)；Eagle培养基、10%的胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美国)；100 U/mL青霉素和100 lg/mL链霉素(上海生工生物科技有限公司)；SDS-PAGE试剂盒(Bio-Rad公司，美国)；CCK8(Dojindo公司，日本)；实验小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)；RIPA裂解液、NC膜，PD-L1、p-STAT3、STAT3抗体(武汉博士德生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 CCK法检测细胞的增殖能力

将骨肉瘤细胞按照1×104个/孔的密度接种在96孔板中，培养过夜.然后将细胞置于舒尼替尼中37 ℃培养24 h，应用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力.

1.2.2 Transwell实验

将骨肉瘤细胞接种于24孔板内，细胞接种量为每孔6×104细胞，Transwell小室孔径为8 μm.Transwell小室细胞在1%胎牛血清的培养基中培养，下室中加入500 μL 10%胎牛血清培养基.培养24 h后，Transwell小室底部细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，再用 4 ℃甲醇固定30 min，然后将固定的细胞用0.1%结晶紫染色.在显微镜下评估迁移的细胞群，每孔分成5个视野，计算迁移细胞个数.实验重复进行3次.

1.2.3 Western blot 法检测PD-L1、 p-STAT3、 STAT3含量

将骨肉瘤KRIB、U2OS、143B、MG 63.2、LM-7和SAOS-2细胞置于Eagle培养基中培养，同时添加10%胎牛血、100 U/mL青霉素和100 lg/mL链霉素，然后收集各组细胞.采用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，再用10%的SDS/PAGE分离，并转移到NC膜上.在脱脂牛奶中封闭1 h后，NC膜在4 ℃(1∶1 000稀释)的PD-L1、 p-STAT3、 STAT3一抗中培育过夜.第2天使用二抗培育后，用Western blot检测系统检测PD-L1、 p-STAT3、 STAT3的含量，使用Image J软件进行结果的量化和统计学分析.

1.2.4 动物模型

选择雌性BALB/c裸鼠(长春市亿斯实验动物技术有限公司)，6～8周龄，体质量约20 g，小鼠在无菌条件下饲养.所有实验流程按照北华大学动物伦理学委员会的现行条例和标准进行.首先将5×106的KHOS/NP人骨肉瘤细胞通过皮下注射方式注射到小鼠的右侧腹部皮下，建立小鼠原发性骨肉瘤模型；通过小鼠尾静脉注射5×106K7M2细胞，建立转移的骨肉瘤肿瘤模型.在注射后的第5天将模型小鼠分为4组，A组给予40 mg/kg舒尼替尼，B组给予10 mg/kg PD-L1，C组给予40 mg/kg舒尼替尼和10 mg/kg PD-L1联合治疗，D组PBS对照，上述药物或试剂均通过腹腔内注射给药，1次/3 d，共4周.每5 d测量1次肿瘤的体积：肿瘤体积=(长度×宽度×宽度)/2，直至小鼠死亡.对于有转移的骨肉瘤小鼠，测量其肺组织质量，同时染色小鼠的肺组织，以确定骨肉瘤细胞百分比.

1.2.5 流式细胞术染色

将单细胞肿瘤置于含5%胎牛血清的RPMI 1 640培养基中培养，通过流式细胞仪检测分析CD5、CD4、CD25和Foxp3染色对调节性T细胞(Tregs)的作用，分析CD8染色对CD8+T细胞的作用.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各骨肉瘤细胞系中PD-L1表达水平

PD-L1表达水平在各骨肉瘤细胞间比较差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，KRIB、U2OS、143B和LM7细胞中表达水平较高，而在MG 63.2和SAOS-2细胞中表达水平较低.见表1.

表1 各骨肉瘤细胞系中PD-L1的表达水平Tab.1 Expression levels of PD-L1 in each osteosarcoma cell line

2.2 舒尼替尼对骨肉瘤细胞转移和侵袭能力的影响

本研究结果显示：舒尼替尼的浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L时，舒尼替尼对KRIB和LM7骨肉瘤细胞的活力影响没有明显差异.见图1.通过Transwell实验发现：舒尼替尼可显著降低KRIB和LM7细胞的转移和侵袭能力，舒尼替尼能有效降低骨肉瘤细胞的转移和侵袭性.见图2 a、2 b.

图1 舒尼替尼在不同浓度时对细胞活性的影响Fig.1 Effect of Sunitinib on cell activity at different concentrations

图2 舒尼替尼对骨肉瘤细胞转移和侵袭能力的影响Fig.2 Effect of Sunitinib on metastasis and invasion of sarcoma cells

2.3 舒尼替尼调控143B和LM7细胞中PD-L1的表达机制

应用舒尼替尼治疗后，通过检测骨肉瘤细胞基因下游STAT3信号分子，证实舒尼替尼可明显降低KRIB和LM7细胞中STAT3的激活.本研究结果表明，舒尼替尼通过调控STAT3的失活而抑制PD-L1的表达.见图3 a和b.

图3 LM7和KRIB中标记物的表达Fig.3 Expression of markers in LM7 and KRIB

2.4 舒尼替尼对骨肉瘤荷瘤小鼠存活率的影响

本研究结果显示：舒尼替尼和a-PD-L1抗体治疗均可抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间，联合治疗效果更明显.在转移癌模型中，应用舒尼替尼和抗PD-L1抗体治疗结果相同，骨肉瘤的平均转移数量显著减少，小鼠的生存时间延长，明显优于接受PBS治疗的对照组小鼠，联合治疗疗效更显著.见图4.

图4 舒尼替尼对骨肉瘤荷瘤小鼠存活率的影响Fig.4 Effect of Sunitinib on survival rate of osteosarcoma bearing mice

2.5 舒尼替尼对骨肉瘤荷瘤小鼠免疫细胞群数量的影响

本研究结果显示：舒尼替尼和抗PD-L1抗体处理组的CD8+T淋巴细胞比例较高，优于对照组；舒尼替尼或抗PD-L1抗体治疗组中的调节性T细胞比例低于对照组，表明舒尼替尼可减少Treg数量，减轻免疫抑制的作用.见图5～6.

图5 各种治疗方案中CD8+T细胞表达Fig.5 Expression of CD8+T cells in various treatment regimens

图6 各种治疗方案中Treg细胞表达Fig.6 Expression of Treg cells in various treatment regimens

3 讨 论

目前，治疗骨肉瘤最有效的方法仍然是新辅助化疗结合手术切除，然而，高达40%的患者接受化疗后还是出现转移，导致治疗失败，因此，寻找有效改善骨肉瘤预后的新途径迫在眉睫.近年来，免疫治疗取得了显著进展[9]，广泛应用于肿瘤治疗，尤其对黑素瘤、非小细胞肺癌和肾癌等，并作为免疫检查点，可预防和维持免疫系统的相对稳定[10-11].由于骨肉瘤的发病机制和免疫特性，骨肉瘤被认为是免疫疗法的完美候选者.

抗血管生成靶向治疗可通过降低肿瘤血管数量使肿瘤血管失活，改变肿瘤的免疫微环境.在一项Ⅲ期随机临床试验中，28例上颌骨肉瘤患者中有1例在接受nivolumab联合pazopanib治疗后得到部分缓解[12].本研究中，2 μmol/L的舒尼替尼作用于骨肉瘤细胞后，能明显减弱骨肉瘤细胞的转移和侵袭性.同时，在骨肉瘤组织细胞中未检测出细胞毒性，提示舒尼替尼对骨肉瘤的转移抑制有积极作用.STAT3转录的信号转换器和激活器是参与肿瘤发展的常见肿瘤信号通路JAK/STAT的重要组成部分，阻断STAT3可增加肿瘤组织中细胞因子和趋化因子的表达，激活先天基因免疫，激活树突状细胞，导致肿瘤T细胞应答.在本研究中，体外肿瘤细胞实验证实舒尼替尼可通过靶向STAT3抑制PD-L1的表达.

近年来，有研究[13]结果显示：舒尼替尼不仅能通过靶向肿瘤细胞进行抗癌作用，还可以增强机体的抗肿瘤免疫能力.本研究结果显示：舒尼替尼增加了肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+T细胞的比例，这可能与肿瘤组织中PD-L1的表达降低有关，我们将在以后的实验中进一步证实.舒尼替尼创造了一个良好的免疫微环境，与肿瘤相应的抗体产生协同作用，从而提高肿瘤特异性抗原细胞毒性T淋巴细胞水平，舒尼替尼通过直接接触癌细胞并释放穿孔素和颗粒酶B杀死癌细胞，因此，开发最佳的联合免疫疗法至关重要.本研究结果显示：舒尼替尼降低了骨肉瘤中肿瘤浸润性Treg的比例，这一发现提示舒尼替尼能够重塑肿瘤的微环境.VEGFR-TKI联合抗PD-L1抗体在骨肉瘤治疗中的作用目前还不清楚.本研究结果显示：舒尼替尼联合抗PD-L1抗体是一种有效的治疗骨肉瘤策略，治疗效果优于单独使用舒尼替尼.本研究结果显示：舒尼替尼可以降低骨肉瘤细胞中PD-L1的表达.这些结果表明舒尼替尼能够增强抗肿瘤活性，其不仅是通过抗血管生成作用，而且还可以通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸.

综上所述，舒尼替尼通过靶向STAT3抑制PD-L1在骨肉瘤细胞中的表达，并且能够衰减转移能力.此外，舒尼替尼可以增加CD8+T细胞的比例，降低骨肉瘤小鼠中Treg的比例，提示舒尼替尼可以重塑肿瘤微环境.我们期待针对骨肉瘤的鸡尾酒免疫治疗(舒尼替尼+PD-1/PD-L1抗体)能在临床实验和实践中发挥更大效能，达到很好的抗癌效果.