ZIF-8纳米载体的制备及负载黄芩素性能研究

时慧 ，汪河滨 ，连培涵 ，杨玲*

(1塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

（2塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（3天水师范学院，甘肃 天水 741001）

金属-有机骨架（metal-organic framework，MOF）作为一种有序结晶结构且含有杂化晶态的配位聚合物多孔材料［1-2］，应用领域十分广泛［3］。其中类沸石咪唑酯金属骨架是MOFs材料中的一个重要分支［4］，在药物递送领域最具代表性的类沸石咪唑酯金属骨架是ZIF-8，其有较高的药物负载率、生物易降解性、多功能性和良好的生物相容性［5］。

黄芩素是高活性黄酮类化合物，能够通过促进胰岛素分泌，增加胰岛素的敏感度从而降低血糖水平，同时也具备抗菌消炎、免疫调节、保肝利胆、抗氧化等多种药理作用［6-7］。但黄芩素半衰期短、水溶性差且体内易分解、生物利用率低等缺点，导致黄芩素在生物体内的使用受到制约［8-9］。

本研究以金属离子Zn2+和有机配体2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MI）制备不同粒径的ZIF-8纳米颗粒［10-13］，并探讨锌盐种类、参与反应原料之间的摩尔比例、反应的温度对产物形貌及结构方面的影响，对比筛选出结晶度高、晶型好的反应条件来制备载体。通过药物分子和金属离子之间的静电相互作用将BA包裹于ZIF-8中形成新型纳米给药体系，解决黄芩素在溶液中易氧化，在碱性［14］条件下易降解的问题。用ZIF-8负载黄芩素后增加对酸环境的响应性释放功能，在体内缓慢释放，延长药物的作用时间，从而减少用药频率避免药物突释后不能被及时有效吸收造成的浪费。同时ZIF-8作为载药材料又具有优异的化学稳定性、热稳定性、细胞毒性低及简单易制备等优点，可广泛应用于纳米给药系统［15-19］。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器设备

甲醇（AR）和无水乙醇（AR）购自天津市鑫铂特化工有限公司；六水合硝酸锌（AR，99%）购自国药集团化学试剂有限公司；二水合乙酸锌（AR，98%）和2-甲基咪唑（98%）购自上海麦克林生化科技有限公司。

LGJ-10C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；Apreo-S场发射扫描电子显微镜，赛默飞世尔科技有限公司；D8 Advance型X射线多晶衍射仪，德国Bruker公司，测试电压40 kV，电流40 mA，辐射源Cu Kα，λ=0.15418 nm，步长0.02°，测试速度0.1 s/step，扫描范围2θ=5°～80°；UV-2600型紫外-可见分光光度计，岛津仪器有限公司，测试扫描范围200～800 nm，精准度1 nm；ZEN3700型Zeta电位仪，英国Malvern有限公司；Frontier型红外光谱仪，Perkin Elmer有限公司，测量波长范围是4000～450 cm-1，精准度1 cm-1。

测得实验数据采用Origin 2018软件进行绘制分析，扫描电镜图用Adobe Photoshop 2021软件处理。

1.2 试验方法

1.2.1 ZIF-8的制备

分别采用硝酸锌、乙酸锌作为金属源，称取1 mmol锌盐溶解于10 mL甲醇，形成溶液A；按不同摩尔比称取2-甲基咪唑溶解于30 mL甲醇，形成溶液B。将溶解后的A、B溶液快速混合，密封搅拌12 h，高速离心收集沉淀，用甲醇洗涤3次除去未反应的原料和杂质。在80℃烘箱中放置6 h干燥后研磨得到白色的固体粉末即为ZIF-8。对比探究不同金属阴离子、反应物摩尔比例、温度对产物的影响，如表1所示。采用SEM观察其形貌及大小，采用FTIRXRD对其进行结构表征。

表1 不同反应条件设置表

1.2.2 药物的装载

按质量比为1∶4称取黄芩素与ZIF-8分别加入适量无水乙醇，超声至药物完全溶解、ZIF-8分散均匀，混合后密封遮光，室温搅拌24 h，用无水乙醇反复离心洗至上清液无色后，低温冷冻干燥得到BA＠ZIF-8。采用扫描电镜观察其形貌及大小。

1.2.3 载药率和包封率计算

配置1 mg/mL的黄芩素无水乙醇溶液作为储备液，分别取不同体积的储备液于10 mL的容量瓶中，定容后得到 17 μg/mL、15 μg/mL、13 μg/mL、11 μg/mL、9 μg/mL、7 μg/mL、5 μg/mL的黄芩素溶液，通过紫外-可见分光光度法测量各溶液在325 nm处的吸光度值，绘制标准曲线。

将经过真空冷冻干燥的BA＠ZIF-8粉末于10 mL容量瓶中，加入30 μL的1 mol/L盐酸和5 mL无水乙醇振荡混匀3 min，至溶液呈澄清透明的淡黄色无沉淀后定容，在325 nm处测得溶液OD值，使用以下公式计算其包封率（EE）和载药率（DLC）：

式（1）、式（2）中：mA为复合物中黄芩素的质量，mg；mB为BA＠ZIF-8复合物的总质量，mg；mC为称取的黄芩素总质量，mg。

1.2.4 黄芩素的稳定性

用移液枪吸取5 mL上述黄芩素贮备液分别溶于45 mL不同pH值 (pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2)的磷酸缓冲溶液和无水乙醇中，用封口膜密封后于暗处磁力搅拌，当搅拌0.2 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h时，分别取样1 mL于容量瓶中用乙醇稀释定容并测量325 nm处的OD值，计算溶液中黄芩素的量。

1.2.5 BA＠ZIF-8的药物释放

将称取的20 mg BA＠ZIF-8均匀分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的磷酸缓冲溶液中，密封后于暗处搅拌，当搅拌0.25 h、1 h、2 h、4 h、6 h、14 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h时，分别取样2 mL离心后倒掉上清液保留沉淀，加入30 μL的1 mol/L盐酸溶解，释放出材料中剩余的黄芩素，用无水乙醇稀释定容后测量325 nm处的OD值以计算剩余黄芩素的质量，并绘制BA释放量曲线。

式（3）中：mB为BA＠ZIF-8复合物的总质量，mg；mD为复合物中剩余的黄芩素质量，mg。

2 结果与分析

2.1 ZIF-8多孔纳米载体材料的制备工艺

制备不同粒径、形貌的ZIF-8，SEM如图1所示。由图1（a）分析可知，采用乙酸锌作为金属源制备的ZIF-8，颗粒表面比较粗糙近似球形，大小不均匀。由图1（b）分析可知，采用硝酸锌作为金属源制备的材料呈十二面体形貌，尺寸均一且边缘棱角明显，说明物质的结晶较好。由图1（c）分析可知，采用硝酸锌作为金属源，在40℃下搅拌4 h制备出的ZIF-8，粒径均低于100 nm。通过改变不同的反应条件对比发现提高2-甲基咪唑与锌离子的反应比例和提高反应温度都可以使晶体粒径变小，提高反应比例是在形成晶核后通过在晶核表面吸附过量的中性配体从而减缓晶核的增长，而提高反应温度可以加快晶体的成核速度，相比之下提高温度的效果更显著，且避免了试剂的浪费。

图1 不同粒径、形貌的ZIF-8的SEM图

分别以硝酸锌、乙酸锌作为金属源与2-甲基咪唑采用1∶8配比室温搅拌12 h制备的ZIF-8样品XRD如图2（a）所示，样品测得多个彼此独立且很窄的“尖峰”，这些特征衍射峰与文献中衍射峰一致［15］，依 次 对 应 (001)、(002)、(112)、(022)、(013)、(222)晶面。由此证明硝酸锌与乙酸锌作为金属源均能成功制备出ZIF-8。不同金属源和物料比制备出的ZIF-8载体材料的衍射峰强度存在很大区别，其中硝酸锌制备ZIF-8的衍射峰相对更强，说明其晶型好、结晶度高。由图2（b）分析可知，硝酸锌与 2-甲基咪唑分别采用 1∶4、1∶6、1∶8 配比制备出ZIF-8的XRD图发现其在小角区的衍射峰，即（001）晶面的峰位随物料比增大而向大角度偏移，且峰强度减弱，说明晶体尺寸减小。综合考虑，后续反应条件选择硝酸盐（1∶4）室温搅拌12 h制备的ZIF-8为药物载体材料。

图2 不同金属源与2-甲基咪唑反应得到ZIF-8的XRD图

2.2 载药ZIF-8纳米粒的表征

采用SEM观测制备的ZIF-8、BA＠ZIF-8形貌，如图3（a）、图3（b）所示。晶体形貌皆呈规则性的菱形十二面晶体形态，与文献［20-21］中的形貌相符，且粒径大小较为均一。负载黄芩素后材料表面变粗糙，但整体形貌变化不大。

图3 （a）ZIF-8与（b）BA＠ZIF-8的SEM图

对比黄芩素标准品、ZIF-8和BA＠ZIF-8载药系统的FTIR如图4所示，分析可知，由于黄芩素含有丰富的羟基，导致在3411 cm-1处形成较大的特征吸收峰，与BA＠ZIF-8中3428 cm-1处的特征峰类似，而ZIF-8中并不存在O—H键伸缩振动。同时BA＠ZIF-8载药系统中在1448～1629 cm-1处也同样出现了黄芩素由于苯环骨架振动产生的吸收峰，ZIF-8中1578 cm-1处的峰归属于C＝N伸缩振动峰，在BA＠ZIF-8中蓝移至1580 cm-1处，由此可以证明黄芩素确实与ZIF-8成功复合。

图4 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的FTIR图

使用Zeta电位分析仪分别检测了BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的去离子水分散胶体溶液，分析胶体微粒的电位情况，以此来判断药物负载是否成功。如图5所示，BA材料的Zeta电位为-47.4 mV、ZIF-8的Zeta电位为22 mV，同时ZIF-8的负载药物BA后的Zeta电位由于ZIF-8表面的负电性被BA的负载部分所中和导致其显著降低至-21.4 mV，由此证明ZIF-8材料成功负载黄芩素。

图5 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的Zeta电位

2.3 药物装载与释放

2.3.1 载药率及包封率

为计算BA＠ZIF-8中黄芩素的包封率与载药率，精准绘制黄芩素标准曲线：A=0.04864C-0.05921（r2=0.99955）。如图6所示黄芩素溶液在5～17 μg/mL范围内呈良好的线性关系。取10 mg BA＠ZIF-8，将其放置于容量瓶中并添加1 mol/L盐酸摇匀使其分解后定容，在325 nm处检测吸光度值代入标准曲线得到其载药率为14.89%，包封率为74.45%。

图6 黄芩素标准曲线

2.3.2 药物的稳定性

黄芩素的结构中含有3个酚羟基，其化学性质并不稳定，在溶液中容易发生化学降解。含有羟基的黄酮易被氧化为醌类衍生物，相关文献［14］对黄芩素降解产物进行了结构鉴定，主要有黄芩素的化学合成前体木蝴蝶素、6，7位邻醌衍生物、苯甲酸苯酯类衍生物等。为了探究BA＠ZIF-8中黄芩素稳定性是否提高，测定了游离黄芩素在不同pH条件下的稳定性。如图7所示，溶解在无水乙醇溶液中黄芩素在1 h后有少量分解，这是由于轻微氧化的原因，在偏酸性环境下(pH 5.4、pH 6.8)黄芩素相对稳定降解较少，在12 h后剩余约86.16%、84.53%的黄芩素，稳定性较好。在弱碱性条件下(pH 7.2)黄芩素稳定性差［22］，可以看到黄芩素在前1 h内快速降解，剩余37.87%，6 h后剩余黄芩素的降解趋于平缓，剩余33.47%。

图7 不同pH条件下和无水乙醇中黄芩素随时间的变化曲线

2.3.3 BA＠ZIF-8在不同pH条件下的药物释放

由于胃肠道周围环境呈弱酸性，而ZIF-8是一种具有酸响应性的框架材料，在酸性条件下，ZIF-8结构会崩塌并释放出包载的药物。为了探究在酸性环境下BA＠ZIF-8中黄芩素的释放行为，对BA＠ZIF-8的酸响应释放行为进行测试。将BA＠ZIF-8分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的PBS溶液中，每隔一段时间取出少量溶液离心保留沉淀，加入1 mol/L盐酸分解ZIF-8，对于载体中剩余黄芩素含量持续观测96 h，绘成曲线如图8所示，证明BA＠ZIF-8包载的黄芩素的释放行为具有明显的pH响应性。在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2环境下黄芩素在前4 h释放速率较快，释放量分别为57.01%、38.97%、28.10%，4 h后释放速率逐渐变小，96 h后在pH 5.4和pH 6.8环境下的释放量达到87.81%、85.53%，而pH 7.2环境下累计释放量为74.39%，表明酸性条件下更有利于药物BA的释放。出现这种情况是因为较多的黄芩素大部分堆积在ZIF-8接近外表面的孔道中，进入内部中心孔道的量相对较少。可见BA＠ZIF-8具有酸响应释放的功能，能够有针对性的释放所包载的黄芩素。

图8 BA＠ZIF-8在不同pH条件下黄芩素随时间变化的释放曲线

3 结论

本实验通过常温搅拌法设计合成了一种负载黄芩素的ZIF纳米材料BA＠ZIF-8。首先制备出结晶度高、形貌好的三维纳米载体材料，进一步合成BA＠ZIF-8复合纳米粒，通过对BA＠ZIF-8纳米粒的多种表征确定，黄芩素不是简单吸附在材料表面而是被封装在ZIF-8框架材料的孔道中，其表面形貌与未负载药物的ZIF-8一致，为十二面体结构，适宜的黄芩素添加量并不影响ZIF-8的晶型。药物释放实验得到的结果充分的证明了BA＠ZIF-8具有较高的包封率和载药率，其在酸环境中也具有响应行为。在酸性条件下BA＠ZIF-8会缓慢释放其包载的黄芩素，96 h后在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2环境下黄芩素的累积释放量分别达到87.81%、85.53%、74.39%。采用ZIF-8作为黄芩素载体在药物负载的同时具有一定的选择性，能有针对性地作用于身体的某一特定部位，有利于实现装载黄芩素的pH响应性释放。