花花柴抗逆相关基因KcCIPK9的克隆及原核表达

陆忻子墨，黄海涛，孔繁雨，李小龙，张晓楠，吴莹莹，杨静，王彦芹

（塔里木大学生命科学学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

植物在生长过程中往往受到多种非生物胁迫因素的影响，其中温度胁迫与干旱胁迫是影响植物生长发育的两类主要非生物胁迫因素。据2018年IPCC相关报告显示，自从工业革命以来人类活动导致全球地表温度较工业化前升高1℃，预计2052年此数据将提高至1.5℃［1］，全球气候变暖导致的降水量重新分配，干旱灾害频发，不仅危害自然生态系统的稳定，还严重威胁人类的生存。然而生长于高温干旱地区的植物在长期的进化和适应过程中能够生存得益于其对胁迫的快速应答和体内复杂的调控机制。

钙调磷酸酶B类蛋白互作激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)家族是一种参与钙信号传导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其具有一个ATP结合结构域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性结构域和一个能与蛋白磷酸酶（PPI）相互作用并带有NAF/FISL序列的调节结构域。其中激活环保守残基的磷酸化可能对调节的酶活性至关重要［2］。Ca2+在参与诱导调控反应时，细胞主要通过钙受体蛋白的EF-hand结构域结合Ca2+的方式来识别并传递Ca2+信号［3］。在植物中发现典型的钙受体蛋白有钙调蛋白(CaM)、类钙调蛋白(CML)家族、钙依赖蛋白激酶（CDPK）家族及钙调磷酸酶B类蛋白（CBL）家族［4］。这类钙受体蛋白作为信号传导路径的组成部分，在功能上被分为“信号继电器”与“信号响应器”［5］。同时拥有感应元件并响应信号产生功能的CDPK被归为信号响应器，而没有产生功能却能传递信号给下游的CaM与CML蛋白为信号继电器，CBLs由于拥有一个直接与之互作的下游蛋白CIPK，其中CBLs负责信号接收和传递，CIPK负责产生环境适应相关功能，所以CBL-CIPK可以作为双分子响应器［6］，并在植物响应逆境胁迫的信号传导过程中产生诸如抗非生物和生物逆境等重要作用。

花花柴（Karelinia caspica）是菊科花花柴属的多年生草本植物，主要分布在我国西北干旱地区，具有优良的耐高温、耐旱、耐盐碱等抗逆境胁迫的能力，是一种用于盐碱地改良、荒漠区生态恢复的优良植物［7］。花花柴根系发达，能吸收大量地下水分［8］，同时叶器官肉质化，保水能力强［9］，叶片能合成大量蜡质以提高其对紫外辐射和极端温度的耐受能力［10］。正因为花花柴对极端环境的适应，进化形成了极强的耐高温、耐旱、耐盐碱等广谱抗逆性，是研究植物抗逆性和挖掘抗逆基因的宝贵资源。

本试验通过克隆荒漠植物花花柴的KcCIPK9基因，并在E.coli中分析其抗逆性功能，为KcCIPK9基因在植物中的功能验证及经济作物抗逆性分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用花花柴种子采自塔里木盆地沙漠公路附近（40°36′N，80°57′E），当地海拔高度为982 m，采样时间为2020年10月5日北京时间14时，当地气温为21℃。所采集的花花柴种子在室内发芽，待花花柴幼苗培养至6～8片真叶时备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

提取花花柴总RNA反转录为cDNA，利用转录组测序结果设计KcCIPK9特异性引物，以花花柴cDNA为模板克隆KcCIPK9基因，将KcCIPK9基因构建至E.coli表达载体pET28a中，将重组质粒pET28a-KcCIPK9转至E.coliBL21中进行诱导表达，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析KcCIPK9基因的原核表达情况。最后分别在高温和干旱处理下分析E.coliBL21的繁殖速率，由此分析KcCIPK9的抗逆功能。

1.2.2 总RNA的提取与cDNA的反转录

1）将处理好的花花柴样品，使用RNA提取试剂盒（RNAprep Pure天根生化科技）提取花花柴幼嫩叶片总RNA。

2）用反 转 录 试 剂盒（EasyScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR北京全式金生物科技）将提取的RNA反转录成cDNA，并将所获得cDNA于-20℃冷冻保存。

1.2.3KcCIPK9基因的克隆

1）引物设计。根据试验室前期结果对花花柴转录组进行测序，分析所测得的转录组数据利用primer 5.0软件进行引物设计，引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2）PCR反应体系。PCR反应使用艾本德Mastercycler®nexus PCR仪器进行，PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

3）PCR反应程序。预变性94℃3 min；94℃解链30 s；55℃退火30 s；72℃延伸90 s；30个循环，72℃延伸5 min。

4）PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，并用天根琼脂糖回收试剂盒胶回收目的DNA片段，将目的片段连接到pMD-18T克隆载体上，转化E.coliDH5α，将鉴定的阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.2.4 原核表达载体的构建

用限制性内切酶XbaI与HindIII分别酶切T载体和原核表达载体pET28a，分别回收目的基因和pET28a的大片段，在T4 DNA ligase的作用下连接pET28a与KcCIPK9，将连接后的产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布到含有25 μg/mL卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，过夜培养后挑取单菌落，利用菌落PCR与质粒酶切验证鉴定；将鉴定的阳性质粒转入E.coliBL21，同样利用菌落PCR鉴定阳性转化子。

1.2.5 原核表达蛋白的提取及SDS-PAGE检测

将上述转化的E.coliBL21阳性菌株在含有卡那霉素抗生素的液体LB培养基中37℃培养12 h，至OD600为0.6～0.8时，加入0.5 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropy-8-d-thiogalactoside，IPTG)，分别取诱导 2 h、4 h、6 h的菌液，于 12000 r/min离心2 min，去上清，于沉淀中加入pH 8.0、10 mmol/L磷酸缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）1 mL，重悬后于12000 r/min离心2 min，去上清，于沉淀中加入1×上样缓冲液200 μL，煮沸10～15 min，对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE检测。

1.2.6 重组菌非生物胁迫耐受性检测

高温处理：以37℃、42℃、47℃、50℃为温度梯度，将实验样品分别在培养4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时取样，测定菌液在OD600处的吸光值。

模拟干旱处理：配置含3%、6%、9%及15%的聚乙二醇-4000（Polyethylene glycol-4000，PEG-4000）的液体LB培养基，分别在实验样品培养4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时取样，测定菌液在OD600处的吸光值。

2 结果分析

2.1 KcCIPK9基因的克隆与原核表达

2.1.1KcCIPK9的序列分析

通过对花花柴KcCIPK9基因PCR结果的电泳检测，发现在1000～1500 bp处有一条亮带（如图1a）；并对构建到pMD-18T载体后转化的E.coli进行菌落PCR鉴定（如图1b）,结果表明载体构建成功。

将构建的原核表达载体pET28a-KcCIPK9通过双酶切验证，在琼脂糖凝胶电泳中出现两条带，其中一条约5000 bp的条带为pET28a的载体，另一条1000～1500 bp之间的条带为KcCIPK9基因（见图1c），表明原核表达载体构建成功。

图1 KcCIPK9的克隆及原核表达载体连接鉴定

通过测序分析（如图2），发现以上所克隆基因的ORF全长为1395 bp，编码464个氨基酸，通过在NCBI上比对发现，其与拟南芥AtCIPK9的同源性高达95%，本试验中命名为KcCIPK9。

图2 KcCIPK9测序结果

2.1.2KcCIPK9基因的原核表达

通过对KcCIPK9基因原核表达蛋白的SDS-PAGE检测，结果表明分别在诱导4 h和6 h条件下有较明显的蛋白条带（如图3），该条带约为50 kDa，与KcCIPK9基因的编码蛋白条带大小相符，表明KcCIPK9基因可以在E.coli中表达。而空载体，诱导时间较短的处理中未见KcCIPK9蛋白条带。

2.1.3 重组菌非生物胁迫耐受性结果分析

高温胁迫组试验结果表明，在37℃条件下，重组载体转化菌的生长速率相比空载体转化菌的生长速度较慢（如图4a），在42℃条件时两种细菌的繁殖速率差别不明显（如图4b），但在47℃、50℃条件下，重组载体转化菌的生长速率明显高于空载体转化菌的生长速率（如图4c和图4d），两种细菌的繁殖速率随着温度的升高在显著降低，但含有KcCIPK9的菌株在高温条件下的繁殖速率高于不含该基因的菌株。

此外PEG渗透胁迫实验组的结果表明，当PEG-4000的浓度在6%以下时（见图5a和图5b），两种转化菌的繁殖速率几乎无差别；当PEG-4000的浓度为9%和15%时（见图5c和图5d），重组载体转化菌的繁殖速率明显高于空载体转化菌，总体上，随着PEG-4000浓度的升高，两种转化菌的增长速率都在降低。该结果显示KcCIPK9基因在一定程度上具有增强E.coli在较高浓度PEG-4000条件下的繁殖速率。

图5 液体培养环境中重组菌的PEG-4000渗透胁迫耐受表现结果

3 结论

本试验从荒漠植物花花柴中成功克隆了KcCIPK9基因的ORF全长，测序结果表明该基因长1395 bp，编码464个氨基酸，其与拟南芥AtCIPK9的同源性为95%；通过构建原核表达载体并在E.coli中诱导表达，获得一条约50 kDa的蛋白条带，这与预期结果相符。对KcCIPK9基因在E.coli中的抗逆性功能分析，结果表明该基因在50℃高温下使阳性转化菌的繁殖速率明显高于阴性转化菌，同样，该基因在15%的PEG-4000环境下使阳性转化菌的繁殖速率明显高于阴性转化菌，表明KcCIPK9基因具有耐高温和耐旱的功能。

花花柴因其所具有的抗逆性状及保水固沙的作用在新疆沙漠植物群落中占有重要地位，朱传应等［11］研究表明花花柴会通过高温对CBL-CIPK通路的诱导表达来提高其对高温的耐受性。DE LA TORRE F等［12］通过沉默烟草NbCBL10与NbCIPK6发现CBL-CIPK信号系统能够与NADPH氧化酶RBOHB互作以此调节ROS的产生，来达到激活烟草的局部细胞程序性死亡（PCD）病原体免疫反应的目的［12］。在盐胁迫方面，小麦TaCIPK14、TaCIPK29和玉米ZmCIPK21在盐胁迫条件下会在钠离子转运、ROS代谢、钾离子平衡和ABA信号传导方面起一定作用［13-15］。二穗短柄草BdCIPK31基因则通过ABA信号通路增强植株对干旱和盐胁迫的抗性［16］。而油菜中多组CBL-CIPK对盐、干旱、冷、热、ABA、甲基紫精（MV）和低盐胁迫可以作出反应［17］，同时对大豆CIPK家族基因的研究表明干旱胁迫也会诱导CIPK家族基因的表达［18］。KcCIPK9基因在原核细胞上的优良表现，使得KcCIPK9基因在真核层面上的抗逆性表现也具有很大的可能。试验结果也为后续真核细胞层面及植物个体上的研究提供了试验基础及理论依据。