超声内镜联合Ki-67、DOG1 表达对胃肠道间质瘤诊断、危险性分级的评估价值

陈丽萍，余志金，陈惠新

（惠州市中心人民医院消化内科，惠州 516001）

胃肠道间质瘤（GIST）是最常见的起源于消化道的间质瘤，每年的发病率为百万分之7.8［1］。GIST 在所有年龄组均有报道，然而，不到10%的患者年龄小于40岁［2］。在成人胃肠道间质瘤中，最常见的原发部位是胃和小肠；在极少数情况下，它们也发生在内脏外的部位，如肠系膜、网膜、骨盆和腹膜后［3］。不幸的是，GIST具有潜在恶性，预后较差，在根治性切除后，肿瘤复发仍然很常见，特别是在高危患者中，超过50%的患者在根治性切除后5 年内复发［4］。寻找合适的方法对GIST尽早进行有效诊断和危险性分级对改善预后有积极作用。超声内镜是GIST 常用的检测手段；Ki67 是一种核蛋白，可指示细胞增殖的程度；DOG1 是GIST 中特异表达的蛋白［5］。因此，本研究探讨超声内镜联合Ki-67、DOG1 表达对胃肠道间质瘤诊断、危险性分级的评估价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015 年1 月～2020 年12 月收治GIST 患者98 例作为GIST 组，男54 例，女44 例；年龄32～71 岁，平均（51.54±4.82）岁；肿瘤部位：胃79 例，小肠12 例，结直肠7 例；肿瘤直径2～18cm，平均（6.25±2.34）cm；组织学类型：梭形细胞型73 例，上皮细胞型15 例，混合型10 例；核分裂数：≤5 个/50 高倍视野（Highpowerfield，HPF）66 例，6～10 个/50HPF 18 例，＞10个/50HPF 14 例；危险度分级（NIH）［6］：极低危12 例，低危28 例，中危36 例，高危22 例。选取同期非GIST 患者（均为内镜诊断黏膜下肿物）30 例作为对照组，男18 例，女12 例；年龄36～68 岁，平均（53.61±3.78）岁；病理类型：胃肠道平滑肌瘤19 例，胃肠道神经鞘瘤11 例。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①GIST 符合《中国胃肠道间质瘤诊断治疗共识》［7］中相关诊断标准，且经术后病理学确诊；②初次确诊为GIST；③均行内镜下或外科手术切除治疗，术前未进行辅助治疗；④术前均行超声内镜检查；⑤具有完整病历资料。排除标准：①合并其他胃肠道疾病患者；②未进行超声内镜检查患者；③合并其他恶性肿瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 超声内镜检查 患者于检查前禁食禁水8h，静脉全麻或表面麻醉，使用FUJINON -7000 超声内镜配合5-20MHz 可调探头采用充盈法和水囊法进行检查。观察并记录病变部位、大小、形状、回声等情况。

1.3.2 Ki-67、DOG1 表达检测 取患者肿瘤组织标本，甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4μm。使用Ki67、DOG1 免疫组化试剂盒（上海谷研实业有限公司）采用过氧化物酶标记的链霉亲和素（SP）法检测Ki-67、DOG1 表达情况。切片常规脱蜡水化，细胞通透液浸润玻片30min，PBS 清洗3 次；将玻片放入0.01M 柠檬酸钠缓冲液（PH6.0）中微波修复抗原，PBS 清洗3 次；加入3%H2O2溶液孵育30min 以阻断内源性过氧化酶，PBS 清洗3 次；加入50μL 适当比例稀释Ki67、DOG1 一抗，4℃孵育过夜，PBS 清洗5 次；加入二抗室温孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素（SP）室温孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；滤纸吸干水分，加入50～100μL DAB，室温反应10min，PBS 清洗3 次；加入苏木素复染，几秒后流水充分冲洗，脱水、透明、封片。

1.4 结果判定

1.4.1 超声内镜量化标准［8］在同一频率下（9 Hz）采集两组患者超声图像，并以JPEG 格式保存。由同一人（不知病理结果）对选取的超声图像利用 Photoshop CS6 13.0 软件中沿病灶轮廓选定测定区间，测定其灰度平均值（回声强度）及灰度标准偏差（回声均匀度）。每张选定图片各测定5 次，取平均值。

1.4.2 Ki-67、DOG1 阳性表达判读 Ki-67 阳性为细胞核有棕黄色颗粒，DOG1 阳性为细胞质或细胞膜着色，每切片随机取400 倍显微镜视野5 个，分别对阳性细胞及总细胞进行计数，计算阳性细胞率。阳性细胞率=（阳性细胞数/总细胞数）×100%。

1.5 统计学方法 使用SPSS 20.0 统计学软件进行统计处理。计量资料以mean±SD 表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用F 检验。绘制受试者工作特征曲线（Receiver Operating Characteristic，ROC），计算曲线下面积（Area Under the Cure，AUC），评估超声内镜、Ki-67 和DOG1 表达水平对诊断GIST 和危险度分级的效能，AUC 比较采用Z 检验。P<0.05 则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者超声内镜、Ki-67、DOG1 表达比较GIST 组超声内镜图像的灰度平均值及灰度标准偏差、Ki-67 和DOG1 表达阳性细胞率均高于对照组（P>0.05），见表1。

表1 两组患者超声内镜、Ki-67、DOG1表达比较

2.2 超声内镜、Ki-67、DOG1 表达对GIST 的诊断价值 分别绘制超声内镜（灰度平均值、灰度标准偏差）、Ki-67、DOG1 表达及其联合诊断GIST 的ROC 曲线，将GIST 作为阳性结果，对照组作为阴性结果。超声内镜图像的灰度平均值诊断GIST 截点为62.83，AUC 为0.841；超声内镜图像的灰度标准偏差诊断GIST 截点为11.56，AUC 为0.743；Ki-67 表达阳性细胞率诊断GIST截点为7.34%，AUC 为0.785；DOG1 表达阳性细胞率诊断GIST 截点为10.69%，AUC 为0.835；联合诊断GIST的AUC 为0.954，高于单独诊断AUC 值（P<0.05）。见图1，见表2。

图1 超声内镜、Ki-67、DOG1表达对诊断GIST的ROC曲线

表2 超声内镜、Ki-67、DOG1表达对诊断GIST的ROC曲线分析各数值

2.3 超声内镜、Ki-67、DOG1 表达与GIST 患者临床特征的关系 GIST 患者肿瘤直径、核分裂数、危险度分级与超声内镜（灰度平均值、灰度标准偏差）、Ki-67 表达阳性细胞率有关（P<0.05），与DOG1 表达阳性细胞率无关（P>0.05）；GIST 患者性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型与超声内镜（灰度平均值、灰度标准偏差）、Ki-67、DOG1 表达阳性细胞率无关（P>0.05）。见表3。

表3 超声内镜、Ki-67、DOG1表达与GIST患者临床特征的关系

2.4 超声内镜、Ki-67、DOG1 表达对GIST 危险度分级的诊断价值 分别绘制超声内镜（灰度平均值、灰度标准偏差）、Ki-67、DOG1 表达及其联合诊断GIST 的ROC 曲线，将中危和高危GIST 作为阳性结果，低危和极低危GIST 作为阴性结果。超声内镜图像的灰度平均值诊断GIST 危险度分级截点为67.34，AUC 为0.822；超声内镜图像的灰度标准偏差诊断GIST 危险度分级截点为13.05，AUC 为0.746；Ki-67 表达阳性细胞率诊断GIST 危险度分级截点为8.90%，AUC 为0.794；DOG1表达阳性细胞率诊断GIST 危险度分级截点为14.85%，AUC 为0.687；联合诊断GIST 危险度分级的AUC 为0.900，高于单独诊断AUC 值（P>0.05）。见图2，见表4。

表4 超声内镜、Ki-67、DOG1表达对GIST危险度分级的ROC曲线分析各数值

图2 超声内镜、Ki-67、DOG1表达对GIST危险度分级的ROC曲线

3 讨论

GIST 是临床中最常见的胃肠道恶性上皮下病变（SEL）［9］。GIST 被认为起源于Cajal 的间质细胞［10］，Cajal 是胃肠道运动的起搏器细胞。GIST 主要是由酪氨酸激酶受体KIT 和血小板来源的生长因子受体-α的致癌突变引起的［11］。约10% ～ 30%的GIST 具有恶性临床病程［12］。此外，有报道称不仅具有高核分裂指数的大型GIST 经常表现出恶性临床病程，具有低核分裂指数的小型GIST 也会表现出恶性转移病程［13］。因此，GIST 被认为是一种潜在的恶性肿瘤。GIST 不分为良性或恶性，而是根据其恶性肿瘤的临床风险进行分层：极低、低、中或高。外科切除是治疗局限性GIST 的主要方法。然而即使肿瘤完全切除，仍有至少一半的胃肠道间质瘤患者术后会复发。尽管已证明酪氨酸激酶抑制剂可为转移患者提供持续的疾病管理［14］，但无转移的小GIST 外科切除术是永久治愈的唯一有希望的治疗方法。早期诊断、早期切除是治疗GIST 的最佳策略。然而，在内窥镜检查中，GIST 经常被检测为SEL。SEL 的鉴别诊断范围很广，可以包括胃肠道外压迫、静脉曲张、异位胰腺和各种肿瘤，包括GIST、SEL 样癌、平滑肌瘤、神经鞘瘤和脂肪瘤［15］。因此，探寻可用于诊断GIST 及危险性分级的有效指标具有重要意义。

超声内镜是评估GIST 的有价值的成像工具，因为它可以显示与正常胃壁的第四低回声层（固有肌层）相邻的低回声病变。目前已经有一些关于使用EUS 鉴别GIST 和良性间质肿瘤的研究［16］，但是，由于主观解释EUS 图像是观察者之间的一致性较差，在分析此类肿瘤的特征方面存在局限性。数字图像由像素组成，像素是构成二维图片的基本元素。在数字图像分析中，使用纹理分析来计算像素的分布和空间变化以提取有用的数据，因此，数字图像分析可提供有关EUS 图像的客观信息，从而可以减少在观察者之间和观察者内部主观性误差。本研究通过Photoshop 将超声内镜图像量化，以灰度平均值表示回声强度，灰度标准偏差表示回声均匀度，结果表明，GIST 组灰度平均值和灰度标准偏差显著高于对照组，并且与患者肿瘤直径、核分裂数、危险度分级相关，同时灰度平均值和灰度标准偏差对GIST 诊断和危险性分级的AUC 值分别为0.841、0.743和0.822、0.746，提示灰度平均值和灰度标准偏差能有效代表超声内镜结果，且能较好的对GIST 进行诊断和分级，与前人研究结果相似［8］。

Ki67 是一种核增殖相关抗原，存在于活跃增殖的细胞中。它在细胞周期的生长和合成阶段表达，但不在G0 阶段（静止阶段）表达。Ki67 的预后价值已经在许多研究中被研究，它作为一个可靠的标志物已经在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌和结直肠癌中被证实［17-19］。因此，肿瘤细胞增殖标志物Ki67 可能是GIST 中有用的预后因素。到目前为止，已有多项研究报道了Ki67表达与GIST 恶性风险之间的相关性。LiH 等［20］报道Ki67 指数与GIST 危险分层和核分裂数呈正相关，并与CT 成像的肿瘤大小、轮廓、边缘相关；Zhou Y 等［21］报道中、高危GIST 患者中Ki67 高表达率多于低危GIST患者，Ki67 高表达可能是恶性GIST 转化风险的有用标志；Segales-Rojas P 等［22］报道Ki67 指数与GIST 复发无关。由于研究结果相互矛盾，样本量有限，Ki67 在预测GIST 恶性肿瘤风险方面的意义仍有争议。在本研究中，GIST 组Ki-67 阳性细胞率显著高于对照组，并且与患者肿瘤直径、核分裂数、危险度分级相关，对GIST诊断和危险性分级的AUC 值分别为0.785、0.794，表明GIST 患者肿瘤恶化程度高于对照组，与现有认知一致，Ki-67 表达情况可作为对GIST 进行诊断和分级的有效指标。

DOG1 属于钙离子激活的氯离子通道（CaCC）蛋白，由于其在大部分GIST 中表达而被证明是重要的诊断标记。CaCCs 在多种组织中表达，并且是正常生理功能的必要调节剂，包括神经元兴奋性、平滑肌细胞收缩、上皮液分泌和胃肠蠕动［23］。具体而言，DOG1 已显示为电压敏感且被配体激活的离子通道，可被增加的细胞内游离Ca2+激活［24］。越来越多的证据表明，DOG1 与肿瘤发生、癌症进展、转移和细胞存活［25-27］。在GIST 中，DOG1 高表达与预后不良有关，其在循环肿瘤细胞中的高水平可预示复发［28］。在本研究中，GIST 组DOG1 阳性细胞率显著高于对照组，但与患者肿瘤直径、核分裂数、危险度分级无关，对GIST 诊断和危险性分级的AUC 值分别为0.835、0.687，表明DOG1 表达检测在诊断GIST 的效能高于诊断GIST 危险性分级，与艾力·赛丁等［29］研究一致。

在本研究中，ROC 曲线分析表明，超声内镜联合Ki-67、DOG1 表达对GIST 诊断和危险性分级的AUC值高于单独诊断，效能更高。提示临床中可检测三者指标以综合评估患者病情，尽早进行干预。本研究也存在一定的局限性，研究样本量较少，需要进一步扩大样本进行研究分析；同时本研究缺乏长期随访，未对患者预后进行分析。

综上所述，GIST 患者超声图像显示回升强、不均匀程度高，Ki-67、DOG1 表达阳性细胞率高，对患者进行超声内镜、Ki-67 和DOG1 表达检测有助于预测病情严重程度。