未成熟卵母细胞体外成熟影响因素及在助孕中的应用进展

徐雅兰，郝永秀，乔杰

(北京大学第三医院妇产科，北京 100191)

1991年，Cha等[1]首次将体外成熟技术(in vitro maturation，IVM)应用于人未成熟卵母细胞，且成功妊娠。目前IVM已成为继体外受精胚胎移植术(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)后辅助生殖的新型手段，也是现代生殖医学领域研究的重点。IVM是指不经药物超促排卵或应用少量促性腺激素从卵巢中获取未成熟卵子，并在适当条件下或体外成熟培养，使成熟后的卵子具备受精能力，然后再将胚胎移植至母亲子宫腔内生长[2-3]。卵子正常生理成熟包括细胞质成熟和细胞核成熟两个同步过程，即卵母细胞核破裂完成第一次减数分裂后，进入并停滞于第二次减数分裂中期[4-5]。受卵母细胞自身及各方面培养条件的影响，IVM实施过程中细胞质成熟与细胞核成熟存在差异，导致IVF率及妊娠率较低[6-7]。随着辅助生殖技术的不断发展，IVM越来越多地应用于临床，以帮助卵母细胞成熟障碍患者成功妊娠。现就未成熟卵母细胞体外成熟影响因素及在助孕中的应用进展予以综述。

1 影响未成熟卵母细胞体外成熟的因素

在现代辅助生殖领域中，IVM为卵巢早衰或切除、遗传病等患者提供了生育机会，同时还有助于了解卵母细胞不同发育阶段的机制及特点，但由于IVM治疗周期多于体外操作，且细胞核、细胞质成熟时间不同，IVM存在卵母细胞培养成熟率低以及IVF率、流产率高等问题。

1.1培养环境 人未成熟卵母细胞体外成熟培养时间为24～48 h，卵子第一成熟期发生于体外培养26 h内，第二成熟期发生于体外培养28 h后，体外培养过程中可能存在成熟度不同的卵母细胞，因此需要不同的培养环境[8]。研究显示，卵子核成熟期间，短暂的高温对 Ⅱ 期卵子纺锤体的形成影响较小，但会对细胞骨架结构产生较大影响，且随着高温持续时间的延长，破坏力逐渐增强，而纺锤体微管、微丝数量及结构变异易导致细胞核骨架、细胞骨架发生不规则改变，降低卵子受精能力以及胚胎的发育能力[9-10]。Cohen等[11]给予卵子成熟期不同氧气浓度，结果发现，5%氧气浓度更利于未成熟的卵母细胞向囊胚转化，而高浓度氧气会延迟卵子的成熟。也有学者发现，行IVM过程中，与20%氧气环境相比，5%氧气环境下对卵母细胞已形成的囊胚冻融，其孵出率显著升高，表明低氧环境下行IVM效果较好[12]。另有报道显示，当硝普钠浓度为1 mmol/L时，其产生的一氧化氮可延迟未成熟卵母细胞在体外成熟培养过程中前5 h内的生发泡破裂，使卵母细胞排出第一极体时间延长至24 h；而当硝普钠浓度达到10 mmol/L时，其产生的一氧化氮可抑制次黄嘌呤分裂，刺激卵母细胞裂解成熟，但一氧化氮对卵母细胞的双重作用机制目前尚未明确[13-14]。以上研究表明，温度、氧气等培养环境可能是影响人未成熟卵母细胞体外成熟的因素之一。

1.2生物化学因素

1.2.1表皮生长因子 有学者认为，表皮生长因子可通过环腺苷酸介导促进细胞分裂增殖，而酪氨酸激酶磷酸化及钙离子依赖性激酶活化均可加速细胞质成熟，进而诱导未成熟卵母细胞裂解，从而促进第一极体排出[15-16]。也有学者认为，表皮生长因子可通过上调缝隙连接蛋白43的表达而影响IVM结果，由于缝隙连接蛋白43具有重要的细胞信号转导作用，因此其高表达可加速卵泡破裂及第一极体形成，从而调节卵母细胞核及细胞质的成熟[17]。此外，表皮生长因子还具有拟黄体生成素的作用，可提高未成熟卵母细胞培养的卵子成熟率，增强卵子受精能力，从而增加囊胚形成率，同时对胚胎发育能力及胚胎冻融过程中的耐受力也有良好的促进作用[18]。

1.2.2白细胞介素(interleukin，IL)-1和卵泡液减数分裂激活固醇(follicular fluid-meiosis activated sterol，FF-MAS) IL-1的发生地及靶器官均为卵巢，IL-1可阻止黄体生成素诱发的未成熟卵母细胞恢复正常减数分裂。Spanou等[19]研究发现，IL-1β与黄体生成素在卵母细胞中共存可抑制黄体生成素诱导分裂，当黄体生成素剂量约为50 ng时，卵子成熟率最低，而加入IL-1β受体拮抗剂可抑制IL-1β的作用，表明合理调控IL-1β受体表达可提升卵母细胞体外成熟率。Ortega-Hrepich等[20]研究发现，FF-MAS可促进卵母细胞恢复减数分裂并进入减数第二次分裂中期，加快IVF后胚胎从双原核期至囊胚期的转变。但FF-MAS仅可促进细胞核成熟，细胞质的成熟仍需通过丰富的培养基提供营养物质而实现。

1.3营养物质 在IVM过程中，卵母细胞核的成熟受FF-MAS、激素等调节，而细胞质的成熟主要由含营养物质的培养基完成。其中，葡萄糖是能量代谢的基础物质之一，不仅参与乳酸盐的生成，还参与细胞外基质的构建。在卵母细胞成熟后期，部分葡萄糖与卵泡刺激素结合，从而增加卵冠丘复合物直径，提高卵子成熟率[21-22]。有研究发现，半胱胺可通过提高细胞内谷胱甘肽的合成速度增加其细胞内浓度，导致亮甲酚蓝实验阳性率显著升高，从而改善正常卵母细胞受精率及胚胎发育能力，但目前尚无确切证据表明半胱胺对卵母细胞核的成熟有积极影响[23]。目前，研究者对于培养基中是否需要加入卵泡液尚存在争议。通过研究骆驼全卵泡液培养基发现，当培养基中完全为卵泡液时，可将未成熟卵母细胞培养至囊胚期，其中含较大卵泡的卵泡液可扩张卵丘颗粒细胞；与含20%卵泡液的培养基相比，全卵泡液培养基细胞核成熟率显著升高，表明全卵泡液培养基在提高细胞核成熟率方面优势显著[24]。但有学者通过观察胚胎发育能力发现，全卵泡液培养基胚胎发育能力不如常规培养基，故如何通过调控卵泡液含量增加胚胎发育能力可作为临床研究体外成熟的新方向[25]。

1.4生理因素 卵丘颗粒细胞与卵母细胞间通过缝隙间接交换物质供给卵母细胞营养物质，以促进卵母细胞成熟，而颗粒细胞的扩张及卵母细胞外空间骨架的形成又与卵母细胞成熟密切相关，卵母细胞、放射冠以及周围的卵丘颗粒细胞形成的卵冠丘复合物培养成熟率远高于裸卵，因此临床可将卵丘颗粒细胞的凋亡作为筛选正常成熟卵母细胞的指标[26]。有研究发现，向含颗粒细胞的卵母细胞中加入生理浓度约为2 ng/mL的表皮生长因子，卵母细胞成熟率显著提高，表明含有颗粒细胞及表皮生长因子的培养基有利于卵母细胞细胞核及细胞质的成熟，对提高体外成熟妊娠率有积极意义[27]。此外，Ailia等[28]将大鼠成熟卵母细胞脱颗粒后行IVF并分别与输卵管上皮细胞、颗粒细胞共同培养，结果发现，与输卵管上皮细胞共存的培养基细胞可发育至囊胚期，且胚胎数量更多，由此可见，上调培养基中的输卵管上皮细胞水平可促进胞质成熟，增加囊胚孵出率。

2 IVM临床助孕的应用范围

2.1在多囊卵巢综合征中的应用 多囊卵巢综合征是以生殖障碍、内分泌异常、代谢紊乱为主要特征的临床综合征，不仅可影响患者的生育能力，还可对孕期、远期及子代的健康产生负性作用[29]。辅助生殖技术是治疗多囊卵巢综合征的主要手段，行IVF时获卵数显著增加，临床妊娠率升高；传统IVF-ET虽可治疗多囊卵巢综合征，但易发生卵巢过度刺激综合征(ovarian hyper stimulation syndrome，OHSS)，而IVM取卵过程中不使用促性腺激素，可避免过度刺激卵巢，且妊娠过程中超声检测次数少，因此具有较高的临床价值[30-31]。Virant-Klun等[32]研究显示，IVM治疗多囊卵巢综合征，妊娠率、种植率及活产率均较高，且取卵前应用卵泡刺激素可获得更多的未成熟卵母细胞，有益于卵母细胞成熟以及胚胎发育能力的提升。Vuong等[33]体外成熟培养从无周期刺激的多囊卵巢综合征患者卵巢中获取的未成熟卵母细胞，并将获得的胚胎移植回母体子宫腔，随访10个月发现，临床妊娠率约为24%，疗效较好。

2.2在IVF卵巢反应不良及卵泡发育迟缓中的应用 传统IVF-ET治疗中偶有卵子发育不良、卵泡发育迟缓等现象，主要表现为卵巢对常规药物促排卵方案反应降低、雌激素水平异常、卵泡数量减少甚至发育停滞，无法获得足够的卵母细胞，进而影响可供移植的胚胎，导致治疗周期的取消率升高，妊娠率降低[34]。既往研究显示，卵泡生长发育具有“卵泡波”特征，若于卵母细胞进入闭锁性程序死亡前，在适宜的条件下进行体外成熟培养，可获得与正常生理过程相似的成熟率，可避免传统促排卵方案刺激下产生的卵巢反应不良及卵泡发育迟缓等问题[35-36]。宋文妍等[37]比较不同方式对81例需助孕治疗的卵巢低反应高龄患者的影响发现，应用IVM的患者卵母细胞体外成熟率达69.8%，可利用胚胎率达70.8%，且未增加妊娠风险，提示IVM可避免常规IVF治疗中出现的卵巢异常现象，使临床获取的卵母细胞有重新利用的机会。

2.3在OHSS中的应用 辅助生殖技术均应用药物促排卵，导致多个卵泡同时发育生长，从而使女性体内雌激素水平显著升高，出现恶心、腹胀、呕吐等症状，即OHSS[38]。有研究纳入51例OHSS患者，并随机分为试验组(27例)和对照组(24例)，两组均在优势卵泡直径≤12 mm时停用促性腺激素，8 h后注射人绒毛膜促性腺激素，其中试验组在36 h后取卵行IVM，对照组在36 h后行IVF，结果显示，与对照组相比，试验组患者OHSS发生率较低，且妊娠率较高，表明IVM可有效预防OHSS的发生[39]。González-Ortega等[40]通过比较常规IVF治疗与IVM在OHSS中的应用发现，IVM妊娠率较高，原因在于当优势卵泡直径≤12 mm时，患者生殖激素水平接近正常生理水平，IVM可降低小卵泡发育异常的风险；此外，IVM可降低排卵周期中生殖激素超生理水平对子宫内膜容受性的影响，有利于胚胎种植及发育生长。

2.4在赠卵受孕中的应用 近年来，生殖系统疾病的发病呈年轻化趋势，而保存尚未生育的年轻患者的生育力对社会发展意义重大。随着医疗科技的不断发展，IVM可在无刺激周期取出未成熟卵母细胞，并在合适条件下进行体外培养获得成熟卵子，帮助需要卵子捐赠的患者，且具有费用低、不良反应少等优势[41-42]。既往研究发现，在人未成熟卵母细胞体外成熟培养期间，采用玻璃化冷冻法保存的减数第二次分裂中期卵母细胞发育潜能高于生发泡期未成熟卵发育潜能，提示卵巢组织经体外培养后可长期冻存，为卵子赠送提供了生殖保险[43]；且IVM实施过程中不需激素超促排卵，无OHSS风险，不仅可避免因胚胎冷冻引发的伦理及法律问题，还为患者提供了多种选择。

3 IVM存在的问题

临床应用IVM助孕时，需模拟正常机体内卵母细胞生存及成熟所需的环境，体外培养时间较长，不能完全保证成熟卵母细胞的质量，加之目前对IVM助孕后产生的子代缺乏大样本研究，因此IVM助孕的子代与正常出生的婴幼儿在成长发育过程中是否存在差异目前尚不明确[44-45]。有学者比较普通婴幼儿与辅助生殖技术出生婴幼儿的发育量表，结果发现，与普通婴幼儿相比，经IVM辅助出生的婴幼儿智力发育指数和神经运动发育指数均无异常[46]。但由于IVM临床应用时间较短，因此对于治疗周期中成熟卵母细胞的遗传学及胚胎发育的分子生物学还应进一步深入研究。此外，目前辅助生殖领域尚无商业化的培养液，需自行配置体外成熟培养基，因此即使采取严格的病原学检查，仍不能避免培养过程中出现病原学交叉感染等问题，从而导致IVM治疗周期中卵母细胞透明带发生硬化，影响卵母细胞的IVF及胚胎孵化过程，不利于妊娠结局，故优化体外成熟培养系统也是亟待解决的问题之一[47]。

4 小 结

IVM具有操作简便、治疗周期短、费用少等优势，但治疗过程中易受培养环境、生物化学、生理等因素影响，因此如何在卵母细胞核成熟的同时提高细胞质的成熟度，从而提高胚胎发育潜能、增加妊娠率，进而扩大其在临床工作中的应用范围是目前亟待解决的问题。IVM虽不能完全替代IVF，但其可应用于多囊卵巢综合征患者，且在避免卵巢反应不良及卵泡发育迟缓、降低OHSS发生风险等方面优越显著。因此，未来可在进一步探索中建立更科学、有效的未成熟卵母细胞体外培养系统，增加助孕途径。