PARP抑制剂在乳腺癌中的作用机制及耐药性相关研究进展

罗青松，张季，李臻，杨思原，孔舷淑，邹天宁

(昆明医科大学第三附属医院乳腺科，昆明 650118)

乳腺癌在女性恶性肿瘤中的发病率较高，对女性的身心健康造成巨大危害。据报道，约10%的乳腺癌具有遗传性，而高达25%的遗传性乳腺癌与生殖有关，目前研究较多的为乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)1和BRCA2，携带BRCA1或BRCA2的人群终生患乳腺癌及卵巢癌的风险较正常人群显著升高[1]。抑癌基因BRCA1和BRCA2可以通过同源重组(homologous recombination，HR)修复进行DNA双链断裂修复，其功能的缺失容易导致基因的不稳定性，进而导致肿瘤细胞的产生[2]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]是一种DNA修复酶，其能够识别DNA受损的片段并被激活，从而进行碱基切除修复，在DNA单链断裂修复、调控程序化细胞死亡、维持DNA稳定中发挥重要作用[3]。BRCA与PARP分别通过不同的信号通路进行DNA损伤的识别与修复，对维持基因的稳定性具有重要意义。研究表明，PARP抑制剂对BRCA1和BRCA2突变的肿瘤细胞异常敏感，因此PARP抑制剂被用于治疗HR缺陷的恶性肿瘤[4]。由于PARP抑制剂能与HR修复缺陷产生协同致死效应，其在治疗BRCA1/2突变癌症患者中取得了重大成功。但PARP抑制剂的临床研究和应用还存在许多问题，其抗肿瘤机制与耐药性分子机制仍未完全明确。现就PARP抑制剂在乳腺癌中的作用机制及耐药性相关研究进展予以综述。

1 PRAP及PARP抑制剂概述

1.1PARP的结构与功能 PARP在DNA修复通路中起关键作用。PARP家族有17个成员，其催化区域具有同源性[5]。PARP家族的酶将聚ADP核糖链与目标蛋白酶共价连接的过程称为多聚核糖基化[6]。在PARP家族的所有蛋白质中，PARP1是最重要的PARP，在DNA损伤修复中，PARP1产生了近90%的多聚核糖基化[7]。PARP1有3个结构域，分别为3个锌指结构(Zn Ⅰ、ZnⅡ、ZnⅢ)构成的N端 DNA结合域、1个BRCA1 C端结合域构成的中间调节域和1个C端催化域，其中C端催化域又由3个亚结构域组成：1个富含色氨酸-甘氨酸-精氨酸域、α螺旋结构域和ADP-核糖基转移酶催化结构域[8]。

在DNA未与PARP结合的状态下，α螺旋结构域可以抑制PARP1中的ADP-核糖基转移酶与β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)结合[9]。当出现DNA单链断裂后，PARP1中的锌指相关结构域识别DNA缺口并与之相互作用，PARP1与受损的DNA链结合后，α螺旋结构域的自抑制功能被取消，从而激活ADP-核糖基转移酶的催化功能，将NAD+分解为烟酰胺和ADP核糖，再将ADP核糖作为底物，使受体蛋白(主要为PARP)自身聚ADP核糖化，形成PARP1-ADP核糖支链[10]。PARP1-ADP核糖支链可以促进DNA修复元件的募集和染色质重塑[11]。而聚腺苷二磷酸核糖水解酶[poly(ADP-ribosy) glycohydrolase，PARG]可以使解离下来的PARP1-ADP核糖支链分解成ADP核糖和PRAP，烟酰胺可以重新利用ADP核糖再次合成NAD+，PARP则可以继续介导DNA损伤修复[12]。

1.2PARP抑制剂的结构与功能 PARP抑制剂的成分主要为NAD+类似物，其可以与NAD+竞争性结合PARP催化结构域的活性位点，使PARP的活性受到抑制，进而影响PARP1-ADP核糖支链的形成并使之不能招募DNA损伤相关修复蛋白，最终造成DNA损伤修复失败[13]。第一代PARP1抑制剂为烟酰胺，其次为3-氨基苯甲酰胺。随后开发的所有PARP1抑制剂均包含烟酰胺/苯甲酰胺药效团，并与NAD+竞争PARP的催化中心[14]。目前，已有4种PARP抑制剂(Rucaparib、Olaparib、Niraparib和Tala-zoparib)获得美国食品药品管理局和欧洲药品管理局的批准。

2 PARP抑制剂在乳腺癌中的作用机制

2.1协同致死效应 协同致死效应即PARP抑制剂可以选择性杀伤BRCA突变引起的HR功能修复缺陷的肿瘤细胞，而对BRCA正常的细胞没有影响[15]。开发PARP抑制剂的基本原理就是基于协同致死性的概念，其中两个基因的突变构成协同致死效应，但是一个单独的突变则可以维持细胞的活力[16]。BRCA1与BRCA2是抑癌基因，它们通过HR参与双链DNA断裂修复，以维持基因组完整性。但BRCA突变的癌细胞存在HR缺陷会导致染色体异常，进而引起染色体的不稳定[17]。有研究显示，PARP1参与了DNA单链断裂的修复，DNA单链断裂的持续损坏可能会引起复制叉的崩塌，从而产生DNA双链断裂，通常由HR来修复[18]。因此，用PARP抑制剂处理过的BRCA突变的癌细胞会累积DNA单链断裂，导致基因双链断裂不能通过HR途径修复，最终引起细胞周期停滞进而死亡[19]。可见，协同致死效应是PARP抑制剂作为一种单药消灭肿瘤细胞的直接作用机制。

2.2PARP-DNA捕获理论 除了协同致死效应外，Murai等[20]提出了PARP抑制剂的第二种作用机制，即将PARP-DNA复合物捕获在DNA损伤部位，由于长期存在的PARP-DNA复合物，细胞持续存在于细胞周期中的S期，被抓捕的DNA就变成了遗传毒性更厉害的DNA双链断裂，最终干扰DNA复制，而捕获PARP-DNA复合物的能力与PARP抑制剂的细胞毒性有关。临床上，PARP抑制剂可根据其捕获PARP的能力进行排名：Talazoparib≥Niraparib>Olaparib=Rucaparib≥Veliparib[21]。这种作用机制是PARP抑制剂的临床开发中需要考虑的因素，无论是单独使用还是在临床试验中常与常规化学疗法结合使用。

2.3其他 PARP抑制剂的细胞毒性是一个多阶段、多步骤的过程。其能通过阻断PARP1与环状鸟苷一磷酸-腺苷一磷酸合酶的互相作用阻止肿瘤的发生[22]。除DNA修复和复制叉的稳定外，PARP1还参与基因表达调控，RNA加工和核糖体的产生，这可能有助于抑制PARP的细胞作用[23]。有文献报道，PARP1能够调节与p53、核受体、核因子κB有关的转录调节因子的活性[24]。因此，转录失调可能会使肿瘤细胞对PARP抑制剂更为敏感，如核因子κB的过度活化能通过PARP抑制剂得以减弱。此外，抑制PARP功能，将会使核仁中的DDX21泄露到细胞核中，从而减少核糖体DNA转录和核糖体的产生，最终抑制乳腺癌的生长[25]。

3 PARP抑制剂在乳腺癌中的耐药分子机制

有研究表明，在携带BRCA突变的患者及小鼠模型中，BRCA突变的携带者对PARP抑制剂的反应效果通常会因高耐药率而受损[26]。此外，另一项关于BRCA突变肿瘤的研究表明，铂类药物的耐药在一定程度能够预测PARP抑制剂也会耐药，表明它们可能具有共同的机制[27]。根据体内和体外研究结果，现已确定了几种耐药机制，见表1。

表1 PARP抑制剂耐药机制

3.1药物外排蛋白的过表达 在缺乏BRCA1的乳腺癌小鼠模型中，大多数对PARP抑制剂表现出耐药性的肿瘤均显示出药物外向转运蛋白基因Abcb1(也称为MDR1)编码的P-糖蛋白过表达[28]。P-糖蛋白是ABC家族的一个成员，可转运细胞分子、营养素、药物和毒素等。文献报道，Abcb1基因的上调会导致癌细胞对化疗药物产生耐药性[29]。但研究显示，P-糖蛋白的底物目前仅有奥拉帕尼和芦卡帕尼，其他PARP抑制剂(如AZD2461、维利帕尼和CEP-8983)均不是P-糖蛋白的底物[30]。同时，长时间使用PARP抑制剂中的奥拉帕尼会提高小鼠癌症模型的P-糖蛋白水平，减少细胞内的药物摄入、使药物外排增加，最终引起药物浓度降低，从而产生耐药[28]。有学者在耐PARP抑制剂的人卵巢癌细胞中观察到Abcb1的过表达，通过加用MDR1抑制剂维拉帕米共同治疗可以逆转其耐药性[31]。然而，P-糖蛋白的过表达与PARP抑制剂的耐药性有关尚未有充足的临床证据。MDR1抑制剂联合PARP抑制剂治疗可能是未来的一种治疗策略。

3.2PARP1和PARG蛋白的变化 PARP1和PARP2作为PARP家族中最重要的成员，也是PARP抑制剂的主要靶标，癌细胞中PARP1表达水平的变化会导致PARP抑制剂产生耐药性。在BRCA1缺失的HCC1937细胞中发现，PARP1表达水平的升高导致PARP抑制剂耐药性的产生，且与乳腺癌患者的预后较差有关[32]。然而，有文献报道，PARP抑制剂的细胞毒性远大于PARP1基因缺失引起的细胞毒性[33]。不同PARP抑制剂抑制PARP蛋白催化活性的能力与PARP抑制剂的细胞毒性能力无关。相反，不同抑制剂在受损染色质上捕获PARP蛋白的能力能够更好地预测细胞毒性[34]。在人类细胞模型中，PARP1和PARP2均被PARP抑制剂——Olaparib捕获在染色质上[34]。然而，由于干扰小RNA介导的PARP1的耗竭能够减弱Olaparib的细胞毒性，因此有学者推断，改变PARP1捕获DNA的能力是PARP抑制剂耐药的机制[31]。这与PARP1是细胞中最丰富的PARP蛋白的结果相符，且PARP1也负责90%细胞的多聚核糖基化修饰[35]。

此外，PARG的缺失和上调也是PARP抑制剂产生耐药性的原因[36]。有研究报道，PARG的缺失部分恢复了PARP抑制剂处理细胞的多聚核糖基化修饰，减少了PARP1对DNA的捕获，挽救了部分依赖DNA损伤信号的PARP1[37]，从而恢复了PARP1的催化活性，阻止了不受控制的复制叉进程，足以使得下游的DNA损伤相关修复蛋白得到补充，进而导致PARP抑制剂产生耐药性。以上数据表明，PARP抑制剂并不能完全阻断PARP活性，内源性PARG活性对PARP抑制剂的细胞毒性作用也至关重要，且这种耐药机制在BRCA2或BRCA1突变的人类细胞系中也被观察到。

3.3HR的恢复

3.3.1BRCA1和BRCA2的重新激活 HR恢复的一个明显机制为继发性遗传改变导致BRCA1/2功能的重新激活。研究显示，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌中，BRCA1/2以及RAD51C、RAD51D和PALB2等基因的许多继发突变，即回复突变，使得阅读框架重新开放，同时还可以恢复蛋白质的活性[38]。有关肿瘤细胞模型的研究表明，回复突变的发生率很高，从而产生了对PARP抑制剂的耐药性[39]。另有研究发现，回复突变通常显示出微同源性特征，表明它们是由原始HR缺陷细胞中通过易错修复机制修复DNA双链断裂的结果[40]。此外，这种回复突变不仅引起PARP抑制剂耐药，还参与了其他破坏DNA药物的耐药。

3.3.2抑制非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ) 有学者发现，恢复HR的第二种方法为抑制NHEJ，DNA双链断裂大部分通过3种途径修复，即HR、NHEJ和微同源介导的末端连接，由于缺乏HR的细胞无法通过HR来修复DNA双链断裂，因此这些细胞中的NHEJ增加，而NHEJ缺陷的细胞会对PARP抑制剂产生耐药性[41]。另有文献报道，HR的恢复是由于p53结合蛋白1(p53 binding protein 1，53BP1)失活而引起，53BP1能通过遏制HR修复所需的DNA末端切除，进而促进NHEJ[42]。因此，失去53BP1功能可促进不依赖BRCA1的末端切除表现出对PARP抑制剂的抵抗。后续研究发现，53BP1 介导的修复下游因子[如RIF1(Rap 1-interacting factor 1，RIF1)和病毒颗粒蛋白表达调节因子 7]的失活也导致DNA末端切除的恢复，从而促进了HR的修复[43]。有学者发现了一个名为Shieldin的53BP1信号转导复合体，其由病毒颗粒蛋白表达调节因子7、SHLD1、SHLD2和 SHLD3组成[44]。Shieldin可以通过限制DNA末端切除而在53BP1途径中充当下游效应因子[45]。从机制上来看，Shieldin复合物直接定位于DNA双链断裂位点，其丢失会损害NHEJ并引起切除过度[41]。同时，由于HR的恢复，Shieldin 基因的突变会导致BRCA1缺失的细胞和肿瘤对PARP抑制剂产生抗性[43]。此外，Dynein轻链LC8型1和HELB解旋酶的失活也可以促进末端切除并恢复独立于53BP1外的HR途径，从而导致BRCA1缺陷细胞对PARP抑制剂产生耐药性[46]。

3.4稳定DNA复制叉 在BRCA1/2缺失的细胞中，稳定的复制叉和HR恢复与DNA双链断裂修复有关，已成为PARP抑制剂耐药性的替代机制。有报道称，在BRCA1/2缺失的情况下，MRE11和MUS81等核酸酶会破坏复制叉，导致新生链缩短，复制叉塌陷和染色体畸变[47]。Zeste 2多梳抑制复合物2亚基的增强子和PTIP(PAX transcription activation domain interacting protein)分别参与将MUS81和MRE11招募到停滞的复制叉中，有学者发现它们可以调节PARP抑制剂的敏感性[47]。有研究显示，miR-493-5p通过下调MRE11和核酸外切酶1从而稳定复制叉，表明miR-493-5p的过表达可诱导BRCA2突变肿瘤对PARP抑制剂产生耐药性[48]。此外，研究还发现ATR/CHK1轴既有助于HR恢复，也有助于BRCA缺陷细胞稳定复制叉[49]。因此，目前正在研究使用ATR/CHK1抑制剂治疗PARP抑制剂耐药性的癌症[49]。同时，SMARCAL1、ZRANB3和HLTF等前叉重塑因子的耗尽也会促进MRE11降解，从而降低对PARP抑制剂的敏感性[50]。

4 小 结

尽管PARP抑制剂在乳腺癌和卵巢癌的临床试验中取得了良好效果，但在临床应用开发PARP抑制剂中还存在许多的挑战：①单一或联合用药的方式及顺序；②Olaparib等药物的水溶性低，不易通过血脑屏障；③长期治疗的安全性；④明确和克服耐药性的机制；⑤PARP抑制剂能对正常组织造成DNA积聚性的损害等。目前已知PARP抑制剂能够抑制PARP1和PARP2，但还需要阐明它们对PARP家族其他成员的作用。因此，有必要增加PARP抑制剂对PARP1的特异性[51]。

在临床治疗中，由于PARP抑制剂的协同致死效应与PARP-DNA捕获理论，其为乳腺恶性肿瘤的诊疗提供了一个有效的治疗靶标，但对PARP抑制剂的耐药性仍是一个需要解决的问题。其中，HR的恢复与稳定的复制叉作为PARP抑制剂重要的耐药机制，有待进一步的研究。虽然目前已对PARP抑制剂的耐药性进行了深入研究，并揭示了不同的机制，但仍需要系统和全面的临床试验来开发克服PARP抑制剂耐药的新策略。