新型矿化胶原膜的体外细胞相容性评价

韩雪 许亦权 李大伟 赵海丹 刘振

（中国人民解放军总医院第八医学中心 口腔科，骨科#，北京 100091）

引导骨再生（Guided Bone Regeneration，GBR）技术是一种有效的增加局部牙槽骨缺损区域中骨数量和质量的方法，其作用机理是利用屏障膜形成一定间隙，有利于成骨细胞占据牙槽骨缺损区，防止非成骨细胞在该区域增殖，从而改善骨的再生并重建牙周组织。屏障膜在GBR 技术中起着重要作用，其特性在一定程度上影响成骨效果。GBR 膜根据能否被吸收分为不可吸收膜和可吸收膜两种，前者包括聚四氟乙烯（PTFE）膜和钛膜，后者包括天然聚合物和合成聚合物。

尽管不可吸收的GBR 膜为牙周再生提供了足够的空间环境，但是二次手术去除膜仍然存在明显的缺陷[1]。此操作增加了新组织受损的风险，也可能会中断愈合过程[1]。为了防止这些问题，可吸收膜成为主要研究方向。目前，胶原蛋白膜是应用最广的可吸收膜[2，3]。为了提高胶原膜的生物活性，北京奥精医药科技有限公司采用体外矿化技术制备了在成分和结构上与人体骨十分接近的矿化胶原膜[4]，该膜为双层膜，疏松层由Ⅰ型胶原和羟基磷灰石组成的矿化胶原层，能够为成骨细胞的活动提供良好的微环境和支架作用，发挥诱导骨再生作用[5，6]；致密层为Ⅰ型胶原，发挥有效的屏蔽作用[7]。孙翼等人[7]通过在犬拔牙窝内植入人工骨修复材料并覆盖该新型矿化胶原膜，观察愈合 3 个月后牙槽骨高度和宽度的变化，并评价新生骨组织的改建情况，发现新骨生成速率与矿化胶原膜材料的降解速率能够实现理想的匹配，有膜覆盖组牙槽嵴轮廓饱满，对照组拔牙区牙槽嵴高度和宽度明显下降，说明该膜具有理想的机械强度和降解性能。本研究进行一系列检测评估该矿化胶原膜材料与MG63 成骨样细胞株的体外细胞相容性，为临床应用提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞和试剂

1.1.1 实验细胞 MG63 成骨样细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.1.2 主要试剂和设备 矿化胶原膜（购自奥精医药科技有限公司，北京），MEM 培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、双抗（中国医学科学院基础医学研究所，北京），细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒（建成，南京），倒置相差显微镜（Leica公司，美国），CO2细胞培养箱（SANYO，日本），超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），平底6 孔板（Corning 公司，美国），扫描电镜（FEI公司，荷兰），流式仪（BD Biosciences，美国）。

1.2 细胞培养

MG63 细胞复苏后，加入含有10%FBS 的MEM 培养液，置于 CO2培养箱中培养。隔天换液，待细胞长满80%～ 85%时，按1∶3 传代。

1.3 HE 染色观察

将无菌矿化胶原膜放置6 孔板内，实验组以2.0×106个/mL 密度将MG63 细胞接种于其表面，每孔100 µL，4 h 待细胞黏附后加入完全培养液；对照组只加入无细胞的完全培养液，置于培养箱培养，隔天换液，培养3 d 后取出样本，用PBS将样品清洗3 遍，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 µm 厚连续切片，行HE 染色观察。

1.4 扫描电镜观察

接种密度及方法同1.3，培养3 d 后取出样本，4% 戊二醛溶液固定，1% 锇酸4℃固定4 h，梯度乙醇脱水，临界点干燥，金属镀膜后扫描电镜下观察。

1.5 浸提液制备

参照 ISO 10993-5：2009 中的细胞毒性试验方法，取矿化胶原膜按 6 cm2/mL 的比例加入含10%FBS 的MEM 培养液，37 ℃浸提24 h，浸提后0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，作为实验组（矿化胶原膜组），4℃保存备用。空白对照组：10%FBS 的MEM 培养液。

1.6 细胞周期检测

将MG63 细胞以2×105的密度接种在矿化胶原膜组及对照组2 种培养基（n=4）中，培养3 天后收集细胞。将细胞在PBS 中漂洗一次，然后重悬于0.3 mL PBS 中，转移至1.2 mL 乙醇-20℃孵育过夜。第二天离心收集细胞，吸尽上清，加入PBS洗涤一次，细胞重悬于100 µL 含RNase A 的PBS 中，并置于37℃水浴中30 min。加入碘化丙锭（PI）进行染色，4℃避光30 min，使用流式细胞仪进行分析。

1.7 细胞凋亡检测

将MG63 细胞以2×105的密度接种在矿化胶原膜组及对照组2 种培养基（n=4）中，3 天后，收集每个瓶中的细胞，用PBS 漂洗两次，重悬于500 μL binding 缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（PI）混匀，避光孵育15 min。用流式细胞仪和CellQuest 软件对样品进行分析，计算各组细胞凋亡率。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件分析实验结果，组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE 染色的结果

细胞接种后3 天，HE 染色（见图1），对照组无细胞附着（图1A），实验组可见大量细胞附着在矿化胶原膜表面（图1B），细胞核清晰可见。该发现表明矿化胶原膜具有良好的细胞相容性。

图1 HE 染色观察

2.2 扫描电镜观察

电镜下观察显示：对照组的矿化胶原膜表面较粗糙，无细胞附着（见图2A）。实验组可见大量扁平较伸展的细胞附着，呈多边形，通过树突状突起与粗糙表面紧密嵌合（见图2B），表明该材料的细胞亲和力较好。

图2 扫描电镜观察（×2000）

2.3 细胞周期结果

表1 是在2组培养液中培养3 d 后，通过流式细胞技术对2组MG63 细胞的细胞周期分析结果，结果显示：2组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。矿化胶原膜浸提液对MG63 成骨细胞的细胞周期无明显影响。

表1 2组细胞在细胞周期段含量比较（）

表1 2组细胞在细胞周期段含量比较（）

2.4 细胞凋亡结果

2组的细胞凋亡率结果见图3。结果显示，对照组和矿化胶原膜组均见大量活细胞集中于左下象限，2组凋亡细胞比例的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 2组细胞凋亡率比较

3 讨论

本实验所用的矿化胶原膜是由致密层和疏松层组成的双层结构，致密层为I 型胶原，疏松层通过体外仿生矿化过程，以胶原分子为模板，引导钙离子、磷离子在胶原分子上和分子间的特定位点形成羟基磷灰石晶核，并进行调控使胶原纤维之间和表面形成周期性有序排列的羟基磷灰石晶体，从而形成微观多孔结构，孔径 50～ 500 µm，孔隙率＞70%，模拟天然松质骨成分和结构[5]，可以交换养分、氧气和代谢废物。这种与人体天然骨基质相似的化学组成和微观结构，为骨细胞提供良好的微环境[5，6]。一方面，双层结构的致密层可作为结缔组织浸润的物理屏障。另一方面，疏松层中矿化的胶原蛋白在诱导骨再生中发挥有效作用，多孔结构又为细胞在孔内的增殖代谢提供了条件，并充当细胞生长的底物。与传统的胶原膜相比，新型复合矿化胶原膜的最大优势在于它可以通过含有羟基磷灰石成分的疏松层诱导骨再生[7]，使该膜具有较强的生物活性，促进形成新的骨组织，有利于引导骨组织再生。

评价生物材料的生物相容性是其应用于临床的必需环节，生物相容性良好才能确保临床应用的安全性。在大量的研究中，细胞毒性试验是一种较快速、价廉且具有高度可重复性的方法，被大多数学者所认可。细胞毒性实验可通过检测生物材料或其浸提液对细胞生长的影响来评价[8，9]，考虑到所检测的新型矿化胶原膜应用于骨组织的修复过程中，材料的接触环境中存在大量的骨细胞。因此，选择MG63 成骨样细胞进行实验。

在本研究中，通过HE 染色（图1）和扫描电镜（图2）观察，我们发现培养3 天后矿化胶原膜表面附着大量细胞，呈多边形，通过树突状突起与粗糙表面紧密接触，表明该材料的细胞亲和力较好。同时，通过流式细胞仪研究了完全培养基和矿化胶原膜浸提液培养的MG63 细胞的细胞周期（表1）和凋亡率（图3），并分析了各相的细胞百分比，没有观察到显著性差异。表明矿化胶原膜不会诱导MG63 细胞的凋亡。Imanieh 等人[10]将犬骨髓基质细胞（dBMSCs）与双层矿化胶原膜结合，体外培养7 天，扫描电镜结果表明，dBMSCs 在膜表面活跃生长，并延伸出许多伪足。同时，分泌了许多细胞外基质，一些伪足相互融合。这些结果表明，双层矿化胶原GBR 膜对dBMSCs具有很强的诱导和促进分化能力。本实验结果与以往研究结果一致，提示矿化胶原膜具有理想的细胞相容性。

4 结论

综上所述，该矿化胶原膜对MG63 细胞生长无抑制作用，具有良好的细胞相容性，并为可吸收性胶原蛋白膜的未来开发和临床应用提供了新的思路。但该材料对骨相关蛋白和基因的影响有待更深入的研究。