新型氟掺杂纳米氧化锆复合树脂填料的制备及其抗菌性能评价

郑俪媛 钱 超 宁聪琴 孙 健

（1.上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海 200011；2.中国科学院上海硅酸盐研究所，高性能陶瓷和超微结构国家重点实验室，上海 200050）

复合树脂充填后边缘继发龋问题常常导致修复体频繁更换甚至充填修复失败，减少继发龋的发生已经成为复合树脂性能优化的重要研究方向[1]。近年来氟化物的应用受到广泛关注，大量研究尝试将氟化物引入复合树脂以达到抑菌防龋的目的，这些氟化物包括低分子有机氟化物或载氟的可聚合单体，及物理掺杂水溶性或微溶性无机氟化物[2]。目前，无机填料掺氟仍是研制含氟树脂的主要方法。然而，研究表明目前这些新型含氟复合树脂材料的释氟性能并不理想，且其释放氟离子的过程往往引起材料结构的破坏，降低其机械强度。随着纳米技术的发展和新材料的研发，纳米氧化锆已被应用于复合树脂填料优化中。一方面，纳米尺寸的无机填料可有效提升材料机械性能、改善美观性能及具备抗菌潜力[3]；另一方面，氧化锆作为一种广泛应用的增强材料，拥有优越的强度和韧性，有利于保持复合树脂的强度[4]。开发可同时发挥氟化物及纳米氧化锆优势的新填料成为一个重要研究方向。

过渡族金属锆在溶液中很难以离子形式简单存在，可表现出很强的形成螯合物的特性，且一个锆离子可与多个氟离子形成配位键，形成高效的“氟库”，这是锆盐被用于饮用水除氟的原因[5]。本研究利用锆离子在溶液中表现出很强的与氟离子形成螯合物的趋势，以氟锆酸铵为氟源，采用化学沉淀法与高温煅烧工艺合成一种高纯度的氟掺杂纳米氧化锆粉体，并对其进行抗菌性能评价，以期获得一种新型抗菌性复合树脂填料，为新型释氟性复合树脂的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 粉体制备

以氟锆酸铵（ZrF6NH4）为氟源，利用化学沉淀与高温煅烧，制备掺氟量分别为10 mol%和20 mol%的氟掺杂纳米氧化锆粉体。首先，将氯氧化锆（ZrOCl2·8H2O）溶解于无水乙醇中，配制浓度为0.5 mol/L 的锆盐溶液，然后依次加入3 mol%的硝酸钇（Y（NO3）3·6H2O）及上述比例的氟锆酸铵，全程将混合溶液置于磁力搅拌器（B11-3，上海司乐仪器有限公司）上持续搅拌充分反应。用氨水缓慢滴定调节pH 至10 得到白色沉淀。抽滤洗涤后，置于100 ℃烘箱干燥处理，得到白色块状前驱体。将前驱体在700 ℃条件下煅烧2 h，自然冷却至室温，即可得到氟掺杂纳米氧化锆粉体。按上述方法制备不含氟纳米氧化锆粉体，最终得到3组不同掺氟量的粉体：0%F-ZrO2，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2。

1.2 晶相分析与形貌表征

运用X 射线衍射分析仪（XRD，D/MAXRBX，Rigaku，大版，日本）以Cu-Kα 作为发射源（波长为0.15418 nm），用于分析3组粉体的晶相结构，分析角度范围：25°～ 65°。采用扫描电子显微镜（SEM，S-4800N，Hitachi，日本）观察样品表面形貌，通过Nano Measurer 软件进行粒径测定。

1.3 释氟量检测

各组称量0.5 g 粉体至离心管中，每管加入10 mL 去离子水，每组设置3 个平行样，超声震荡10 min 使粉体充分分散，将小管放置在37 ℃恒温摇床中24 h。离心后取各管内上层清液，利用离子色谱仪（ICS-1100，DIONEX，美国）测量溶液中氟离子含量。

1.4 抗菌性能研究

1.4.1 细菌培养 实验选用变形链球菌（UA159）菌株进行抗菌实验，标准菌株由上海交通大学附属第九人民医院口腔微生态与系统性疾病实验室提供。实验菌种培养条件为37 ℃二氧化碳培养箱（Whitley DG250，Don whitley scientific，英国）。抗菌实验前，染色镜检为纯培养物后，利用酶标仪（Elx800，BioTek，美国）调节菌液浓度。

1.4.2 琼脂扩散实验（Agar-diffusion）将各组粉体压制为10 mm×1 mm 的样品片（0.2 g/片，n=3），紫外灯照射2 h 灭菌备用。琼脂扩散实验前，将菌液浓度调节为1×107CFUs/mL。每次取50 μL菌液用玻璃推棒均匀涂抹在BHI 琼脂板上，然后将一个灭菌样品片置于琼脂板表面中心，放入培养箱中培养24 h，观察样品片周围是否出现抑菌环，若有，则用游标卡尺测量抑菌环直径。抑菌环直径＞10 mm 则认为该样品片具有离子释放抗菌效果，实验重复3次。

1.4.3 最低抑菌/杀菌浓度（MIC/MBC）测试 将各组粉体分散于BHI 培养基中制成悬浊液，超声震荡使其充分分散均匀，高温灭菌后利用二倍稀释法将其稀释至10 个浓度梯度（80 mg/mL～156 μg/mL），然后每组每浓度取200 μL悬浊液至灭菌96 孔细胞培养板与20 μL 菌液（1×106CFUs/mL）共培养24 h，然后将各微孔中菌悬液吹打混匀，用接种环取出在BHI 琼脂板上划线，再将该琼脂板置于培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况。实验设置阴性对照组和未处理组，阴性对照组中为等体积粉体悬浊液，未处理组中为等体积同浓度菌悬液。每组设置3 个副孔，实验重复3次。

1.4.4 菌落计数实验（CFUs） 各组称量（0.02±0.002）g 粉体至细菌培养管，紫外照射2 h灭菌，实验前将菌液浓度调节为1×106CFUs/mL。向每个培养管中加入2 mL 灭菌BHI 培养基，再加入20 μL 菌液，充分震荡使粉体与细菌充分接触。培养24 h 后，充分震荡混匀菌悬液，稀释涂板，继续培养48 h 后进行菌落计数。实验设置阴性对照组和未处理组，阴性对照组为等量未接种细菌的粉体悬浊液，未处理组为等体积同浓度菌悬液。每组设置3 个平行样，实验重复3次。抑菌率可通过以下公式计算：

抑菌率=（未处理组菌落数-实验组菌落数）/未处理组菌落数×100%

1.5 统计学分析

采用SPSS 25 统计软件对上述实验结果进行统计分析，采用单因素方差分析和事后分析比较多样本之间差异。数据表示为平均值±标准差（），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 晶相分析及形貌表征

从3组粉体XRD 图谱（图1）可以看出，经700 ℃煅烧的纳米氧化锆粉体同时存在两种晶相：四方相（t 相，PDF＃79-1765）和单斜相（m 相，PDF＃86-1449）。随着氟掺杂量的增加，t 相逐渐被抑制，m 相峰值逐渐变强。与此同时，SEM图像可见各组粉体均为粒径较均匀的纳米级粉体，通过Nano Measurer 软件进行粒径测定，3组粉体颗粒粒径均在15～ 70 nm 范围，平均粒径依次为29.79 nm，44.25 nm 和46.64 nm（图2～3）。

图1 氟掺杂纳米氧化锆粉体晶相XRD 图谱

图2 氟掺杂纳米氧化锆粉体粒径分布

2.2 释氟量检测

图3 氟掺杂纳米氧化锆粉体SEM 表面形貌

氟掺杂纳米氧化锆粉体24 h 内释氟量检测结果见表1，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2粉体样品均有氟离子释放，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 氟掺杂纳米氧化锆粉体释氟量（x±s）

2.3 抗菌性评价

图4和表2显示琼脂扩散实验结果图及抑菌环测量结果，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2样品片周围均出现明显抑菌环，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

图4 氟掺杂纳米氧化锆粉体样品片琼脂扩散实验的结果

表2 抑菌环直径测量结果（x±s）

最小抑菌/杀菌实验结果（图5）显示当粉体浓度达10 mg/mL 时，10%F-ZrO2和20%F-ZrO2两组粉体相应培养皿中菌落数明显变少，具有抑菌效果；当浓度增大达到20 mg/mL 时，不见菌落生长，达到杀菌效果。以上两组掺氟粉体抑菌/杀菌效果相当（图5 B 和C）且均明显优于0%F-ZrO2组（图5 A）。

图5 氟掺杂纳米氧化锆粉体最小抑菌/杀菌实验的结果

图6 为氟掺杂纳米氧化锆粉体与变形链球菌共培养后涂板结果图，与未处理组及0%F-ZrO2组相比，掺氟粉体的加入使变形链球菌的数量明显减少，且在实验研究范围内抗菌效果随氟含量增加而愈加明显。进行菌落计数并计算各组材料抑菌率（表3），各组间菌落数差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 菌落计数结果

图6 氟掺杂纳米氧化锆粉体与变形链球菌共培养后涂板的结果

3 讨论

3.1 含氟口腔复合树脂材料研究现状

自20 世纪70 年代以来，大量研究致力于含氟复合树脂材料的研发工作，有学者将氟化钠、氟化钾等可溶性氟盐掺入无机填料，这种方法简单易行，但由于其高水溶性，氟离子释放仅持续1～ 2 天，此后释氟量骤减，且释氟导致材料产生多孔结构，机械性能变差[6-8]。相比之下，可缓释氟的玻璃离子填料及微溶性氟盐如氟化钙、生物活性玻璃等，因溶解度小，释氟进程更加缓慢和持续，复合树脂机械性能得以保存[9，10]。目前对含氟复合树脂材料的研究仍存在抗菌有效性和影响材料本身理化性能等问题。主要是物理掺杂的氟化物无法与无机填料形成良好的化学结合，氟离子的释放往往表现为短暂的突释，且会明显损害材料的致密结构。因此，要获得更高效的含氟复合树脂材料，必须从材料的微观结构入手。近年来，纳米氧化锆填料在提升材料机械性能、改善美观性能及良好的抗菌潜力方面，比之大尺寸填料表现出明显的优势[11]。如今，掺杂纳米氧化锆填料的复合树脂产品如3M 公司的Filtek Z350 和Ketac Nano 已经在临床上广泛应用[12]。因此，将氟化物与纳米氧化锆填料有效结合成为了一种全新的思路。

3.2 新型氟掺杂纳米氧化锆填料的合成与表征

为实现上述想法，以何种方式将氟化物结合到纳米氧化锆微粒中是要解决的首要问题。考虑到金属锆离子在溶液中可以高效结合氟离子，从而实现两者的化学结合。且此前Burgess 团队首次合成一种含有三氟化锆螯合物的新型复合树脂单体，利用这种单体创建高效的“氟库”[13]，这也证明了金属锆离子的螯合作用可被应用于口腔材料中。因此，本实验中采用化学沉淀法使氯氧化锆和氟锆酸铵在溶液中充分反应，并通过高温煅烧的方法获得高纯度的氟掺杂纳米氧化锆粉体。通过粉体释氟量检测，结果证明粉体有氟离子有效释放（表1）。此外，晶相分析和表面形貌表征结果（图1）显示氟离子的添加不改变氧化锆粉体的微观形貌，但可引起氧化锆晶相变化，四方相峰值减弱而单斜相峰值增高，且变化程度与掺氟量成正相关。这些都直接或间接说明了本实验氟化物与纳米氧化锆微粒的有效结合。但单纯通过以上表征手段尚无法准确判断氟离子在氧化锆晶格中的键合形式，仍需后续实验进一步研究其结合机理。

3.3 新型氟掺杂纳米氧化锆填料的抗菌性能评价

众所周知，龋病的发生不是因为缺乏氟化物，但氟化物已被证实确能起到有效的抑菌抗龋作用。氟离子可作用于以变形链球菌为主的产酸口腔菌群，抑制细菌中与糖酵解和细胞氧化有关的酶，也可抑制细菌摄入葡萄糖，影响细菌产酸。Marquis R.E.等人进行体外实验认为：低浓度的氟离子时即可发挥抑制变形链球菌生长的效果[14]。为验证粉体释氟对变形链球菌的抗菌效果，本实验采用琼脂扩散实验，最小抑菌/杀菌浓度测定和细菌涂板计数3 种经典定性和定量实验方法进行材料抗菌性能评价[15]。琼脂扩散实验是评价释出型抗菌材料抗菌性的重要方法，通过这种方法可验证本实验粉体通过氟离子释出达到抑菌作用，且此结果（图2 及表2）与粉体释氟量测定结果（表1）相一致。由于氟离子的抗菌作用受实验细菌浓度及周围环境pH 值等因素影响[16]，利用最小抑菌/抗菌浓度测试可确定本实验条件下，10%F-ZrO2组和20%F-ZrO2组粉体在20 mg/mL 浓度时可达到显著的杀菌作用。综合菌落计数结果计算各组粉体的抑菌率可知，本实验制备的这种新型氟掺杂纳米氧化锆填料可有效抑制口腔变形链球菌的生长繁殖，在本实验研究范围内，20%F-ZrO2组粉体表现出最佳的抑菌效果。未来我们将对粉体进行优化筛选，进一步研制兼具抑菌抗龋功能且满足临床性能要求的新型材料。

4 结论

综上所述，本实验成功制备氟掺杂纳米氧化锆粉体，具备优异的抗菌效果，为此后进行新型含氟复合树脂材料的研究打下基础，在口腔充填修复领域具有良好的应用前景。