生命素一号抗人胚肺MRC-5成纤维细胞衰老的机制

王金彩，陈阳，何琪杨

中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所，北京，100050

随着年龄的增加，人体出现生理功能和结构的衰老性退化，对营养素的消化和吸收也发生明显下降，从而影响如心脑血管疾病、糖尿病和癌症等多种老年相关慢性病的发生和疗效[1]。因此，及时有效地补充各种营养素显得十分重要[2]。生命素一号（shengming-1,SM-1）就是为了上述目的而科学组合的1 种包含主要营养素的混合产品，其中含维生素E 和维生素B 等多种维生素，硒、锌、镁等微量和常量元素，虾青素等天然抗氧化剂。

细胞衰老是人体整体衰老的基础，是判断干预产品是否有效的评价指标[3-4]。从延缓细胞衰老角度，评价健康产品和功能食品的初步功效是一种有效、成本较低的方法，尤其适用于评价影响长寿和老年健康的产品[5]。为了更好地阐明SM-1 的健康功效，利用过氧化氢诱导的人胚肺MRC-5 成纤维细胞衰老模型，与标准的抗氧化剂乙酰半胱氨酸-acetylcysteine,NAC）作为阳性比较[6]，评价SM-1 的抗细胞衰老作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂 SM-1 由仁德康泰（天津）健康管理有限公司提供（编号RDKT-SMS-2021.03.06），溶于二甲基亚砜+乙醇（50%+50%）的混合液中，配制成终浓度为50 mmol/L 的母液。NAC（S1623）购自美国Selleck 公司，溶于无菌水中。配成终浓度为100 mmol/L 的母液，储存在-20 ℃冰箱中备用。过氧化氢（H2O2，货号75-91-2）购自ALDRICH Chemistry，使用前配制。

细胞衰老-半乳糖苷酶染色试剂盒（C0602）购自上海碧云天生物技术有限公司。荧光染料DCFHDA（D6883）和碘化丙锭（PI，P4107）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。DCFH-DA 配制成浓度为5 mmol/L 的母液，分装后储存在-20 ℃冰箱中备用。细胞增殖检测试剂盒（Cell counting kit-8(CCK-8)，B34304) 购自美国Bimake 公司。蛋白浓度测定液（#500-0205）和化学发光液（ClarityTMWestern ECL Substrate）购自美国BIO-RAD 公司。胎牛血清(10099-141)、MEM 培养基（C11095500BT）、0.25%的胰蛋白酶(25200-72)和HBSS 缓冲液（C14175500BT）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 细胞来源和培养 人胚肺MRC-5 成纤维细胞购自美国模式生物保藏中心（ATCC）。在含10%胎牛血清的MEM 培养基中培养，培养条件为5% CO2、温度为37 ℃。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK-8 法检测细胞增殖 取对数生长期的细胞，以4 000 个/孔的密度接种于96 孔板，24 h 后使用药物处理，培养72 h，检测方法同前[7]。在450 nm 处测定光密度值。细胞存活率= (药物处理组背景组/ (对照组-背景组× 100%。在GraphPad Prism 5 中绘制细胞存活率曲线。

1.3.2 蛋白免疫印迹法 将细胞以40 万/孔接种于60 mm的培养皿中，24 h 后使用SM-1 或NAC 处理细胞24 h。收集细胞，细胞裂解，测定蛋白浓度，12.5%SDSPAGE 凝胶分离蛋白，转膜及抗体温育，图像检测的方法同前[7]。兔抗P16 抗体（1∶1 000，ab51243）购自美国Abcam 公司、P-21（1∶1 000，#2947）购自美国Cell Signal Technology 有限公司, 小鼠抗P53 抗体（1∶1 000，sc-126）购自美国Santa Cruz Biotechnolongy 公司。抗兔二抗（1∶1 000，HS101-01）和抗小鼠二抗（1∶1 000，HS201）购自北京转基因生物技术有限公司。

1.3.3 衰老细胞的染色 把对数生长期细胞以2 万/孔接种于12 孔板中，24 h 进行实验。使用SM-1 或NAC预处理细胞2 h，然后加入H2O2处理1 h，吸去药液，使用无血清MEM 培养基洗2 遍，继续在细胞培养箱中培养3 d，然后换新鲜培养基，继续培养2 d。衰老细胞染色按照厂家提供的方法进行，在37 ℃温箱中孵育过夜。换成PBS 溶液，在倒置显微镜下观察和拍照，按照300 个细胞含蓝色细胞数作为衰老细胞阳性率。

1.3.4 活性氧自由基（reactive oxidative species, ROS）的检测 把对数生长期的细胞以30 万/孔传于6 孔板中，培养24 h 后，进行相关处理，染色方法同前。染料DCFH-DA 的终浓度为10，染色30 min，用胰酶消化细胞，离心收集细胞。使用流式细胞仪检测荧光强度，然后使用FlowJo 7.6.1 分析相对荧光强度。

1.4 统计学分析 使用SPSS19.0 统计软件进行分析数据。实验数据以均数±标准差（±s）表示，为3 次实验结果的平均值。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SM-1 具有促进MRC-5细胞增殖的作用 由于SM-1是一种多种营养素的混合物，本实验选择了较大范围的浓度处理细胞，较高浓度200对细胞增殖有轻微的抑制作用，细胞存活率为95.2%（图1 A），与对照组相比较（设定为100%），低于100 g/mL SM-1对细胞增殖均有一定的促进作用，在10 g/mL 时该作用更明显（图1 A）。

图1 生命素一号促进MRC-5 细胞的增殖作用

在细胞培养中，胎牛血清的含有促进细胞增殖的生长因子，为探究SM-1 是否具有与生长因子类似的作用，本实验降低血清浓度以观察SM-1 对细胞增殖的影响。结果表明，在2.5%、5%血清浓度下，SM-1对细胞增殖没有明显的促进作用；而在10%血清浓度下，10、20 g/mL SM-1 均有较明显促进增殖作用（图1 B）。本实验也进一步验证了图1 A 的促进增殖作用的结果。

2.2 SM-1 具有较强的抗H2O2抑制细胞增殖的作用 使用预处理的方法，观察SM-1 的作用。阳性化合物NAC 单独处理细胞可以促进细胞增殖＜0.05），10 mol/L NAC 可将细胞存活率提升10.4%。NAC 处理有明显的抗H2O2引起的增殖抑制作用，40 mol/L H2O2单独处理后细胞存活率为49.6%，NAC 可恢复细胞增殖，且有浓度依赖性，最高可将细胞存活率提升至65.9%＜0.001)（图2A）。80 mol/L H2O2处理的情况下，NAC 也有一定的抗H2O2抑制增殖作用，但无明显统计学差异。

选择低质量浓度（10 g/mL 以下）的SM-1 对H2O2引起的细胞增殖抑制的影响。SM-1 单独处理细胞也可以促进细胞增殖，10 g/mL SM-1 可将细胞存活率最高提升14.4%＜0.001)。SM-1 预处理有明显的抗H2O2引起的增殖抑制作用，40 mol/L H2O2单独处理后细胞存活率为49.6%，SM-1 可将细胞存活率提高16.3%，且有浓度依赖性＜0.05)（图2B）。80 mol/L H2O2处理组与NAC 处理结果有所不同，SM-1有一定的抗H2O2抑制增殖作用，且高浓度组具有统计学差异＜0.05)。

图2 SM-1 具有较强的抗H2O2 抑制细胞增殖的作用

2.3 SM-1 抑制H2O2诱导的MRC-5 细胞衰老的作用衰老细胞通常体积变大，并表达高活性的-半乳糖苷酶，使用X-Gal 为底物，在-半乳糖苷酶的催化下生成深蓝色产物，在光学显微镜下很容易观察到阳性细胞。如图3A 所示，SM-1 或NAC 单独处理时，细胞衰老不明显。H2O2单独处理会使细胞膨大，诱导细胞衰老，被染成蓝色的衰老细胞明显增多。而加SM-1后，与NAC 作用类似，被染成蓝色的衰老细胞数量明显变少，80 mol/L H2O2单独处理最多可诱导24.7%的细胞发生衰老，SM-1 处理将衰老细胞在降至11%左右。统计阳性细胞是数目也表明：SM-1 能明显地减少H2O2诱导的衰老细胞数量（图3B），具有抗细胞衰老的作用。

图3 SM-1 明显减少H2O2 引起的衰老细胞数量

2.4 SM-1 对H2O2诱导的MRC-5 细胞活性氧自由基的作用 细胞衰老过程中，往往是ROS 的升高。经过H2O2短暂处理，加SM-1 或NAC 继续处理细胞24 h,使用ROS 的特异荧光染色，流式细胞仪检测分析表明：阳性化合物NAC 具有明显的降低ROS 的作用。SM-1 单独处理对ROS 的水平无明显影响，H2O2单独处理可引起ROS 明显增加，而加SM-1 处理后可降低H2O2引起的ROS 水平，说明SM-1 具有降低ROS 的作用（图4）。

图4 SM-1 降低H2O2 引起的ROS 水平

2.5 SM-1 对H2O2诱导的MRC-5 细胞相关衰老蛋白的影响 除了上述指标变化外，本研究进一步使用蛋白免疫印迹法分析SM-1 对衰老相关蛋白的影响。与NAC 作用类似，SM-1 单独处理对衰老相关蛋白表达的影响不大，但能明显降低H2O2诱导的p53，p16 和p27 的表达水平（图5），说明SM-1 的抗细胞衰老作用与相关蛋白表达下降相关。

图5 SM-1 降低H2O2 引起的衰老相关蛋白的表达

3 讨论

通过细胞增殖实验、衰老细胞特异染色、活性氧自由基分析及衰老相关的蛋白表达变化等指标表明：生命素一号具有一定的抗细胞衰老作用。其作用机制与抗氧化及降低衰老相关的蛋白表达相关。从抗细胞衰老角度，本研究结果进一步说明了生命素一号营养素组方的合理性和科学性，为人体应用提供了可靠的实验依据。

本研究使用了标准抗氧化剂NAC，这是抗氧化实验最常用的化合物，也是临床治疗疾病的药物[6]。从增殖抑制指标看，SM-1 的作用效果与NAC 相当，说明SM-1 的组合具有较好的促进健康的优势。在检测NAC 的抑制ROS 变化时，并不是随着NAC 浓度的增加，ROS 的水平明显下降（结果未显示）。细胞增殖实验也表现出相似的趋势，过高浓度的NAC 反而增加H2O2的抑制细胞增殖作用，SM-1 也具有相似的作用特征。为了真实反映SM-1 的作用特征，通过预实验确定合适的作用浓度是十分关键的，无论对阳性药物NAC 还是检测的化合物均是如此。

从细胞增殖指标判断，较低浓度的SM-1 单独处理细胞，具有一定的促进细胞增殖的效应＜0.01）（图1～2），该作用特征能有效解释该混合物的多功能作用特点。联系到NAC 也有此作用（图2），在以前的报道中发现富硒麦芽粉水溶液单独处理细胞，也有促进细胞增殖的效应[7]，提示这可能是具有抗细胞衰老的营养素或药物的一个标志性特征。这是否可以作为普遍的特征，有待检测更多的化合物后才能完全确定。

SM-1 含有多种成分，如微量元素硒、多种维生素等。近年来的研究发现营养素对改善慢性病的治疗和患者康复具有巨大的作用。微量元素硒对改善人体健康有多方面的作用，具有抗病毒、抗肿瘤、延长寿命等功能[8]。近期发现硒还能明显改善小鼠的卒中症状[9]，说明其作用的多效性。癌症是目前临床治疗未被满足要求的重大慢性病，近年来发现许多营养素如丝氨酸、甘露糖等影响癌症患者的肿瘤进展及治疗效果，展示了从营养素角度改善癌症治疗的诱人前景[10]。

本研究结果确定了生命素一号具有抗细胞衰老效应，促进细胞增殖等作用，其机制与抗氧化及抑制衰老相关的蛋白相关。因本实验只是细胞的体外实验，需要动物和人体实验进一步证明。本研究结果可为生命素一号在中老年人群中的应用及其辅助减轻慢性病等作用提供科学依据。