基于超高效合相色谱技术的保健食品中肉碱对映体拆分和测定方法研究

张文华，谢 文，侯建波，汪 鹏，徐敦明，姚滨滨，何建敏，严颖鹏

（1.杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016；2.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016；3.厦门海关技术中心，福建 厦门 361026）

肉碱的化学名称为β-羟基-γ-三甲胺基丁酸，其分子中含有1 个手性碳原子，有2 个立体异构体：右旋肉碱（D-肉碱）和左旋肉碱（L-肉碱）对映异构体。其中左旋肉碱又称L-肉碱或卡尼丁，广泛分布于肝脏器官中，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸［1］，同时也是脂肪酸在线粒体内代谢的必需物质，其缺乏可直接导致能量的合成不足，出现易疲劳、肌无力等症状。目前，市售保健食品中所用的L-肉碱主要来源于工业上的化学合成法，但该方法生产的L-肉碱纯度通常达不到要求，导致L-肉碱保健品中含有D-肉碱［2］。而D-肉碱不但没有功效，甚至具有毒性。人摄入D-肉碱，肌肉会受到损害，造成肌无力、肌疼痛、肌萎缩等症状［3］。因此，迫切需要建立一种保健食品中L-肉碱的纯度分析与含量测定的方法。

目前，L-肉碱的检测方法主要为分光光度法［4－5］、高效液相色谱法（HPLC）［6－7］、高效液相色谱－串联质谱法［5，8－10］等。但上述方法基本是针对L-肉碱进行检测，而对D-肉碱和L-肉碱2 种对映体的拆分以及L-肉碱纯度分析的方法报道较少。翟旭峰［11］和祝伟霞［2］等采用反向高效液相色谱法实现了L-肉碱和D-肉碱的基线分离，但方法存在分析时间长（>20 min）、有机试剂用量大等问题。近年来新推出的超高效合相色谱技术（UPC2）受到了广泛关注，该技术是将超高效液相色谱（UPLC）与传统超临界流体色谱（SFC）的特点相互补充，改进了传统SFC 的各项硬件［12］，利用超临界二氧化碳与少量有机溶剂（乙腈、甲醇、异丙醇等）为流动相，能精准调控待测物的保留时间和分离度，提高系统的精密度、稳定性和可靠性［13］。研究表明，UPC2技术更适于分析传统液相色谱难以处理的结构类似物和同分异构体，已被成功应用于三唑类农药［14］、酚酸类化合物［15］、色素［16］、酚类精油［17］等。目前，UPC2技术应用于肉碱对映体的拆分和含量测定尚未见报道。

为解决上述常规液相色谱法拆分对映体存在的问题，本研究建立了一种超高效合相色谱拆分肉碱对映体及测定其在保健食品中含量的方法。实验考察了2 种肉碱对映体标准品衍生产物的稳定性，优化了保健食品中肉碱对映体的提取方法、衍生条件以及色谱分离条件等，并利用所建立的方法对肉碱外消旋体标准品和市售保健食品进行检测。该方法具有分析速度快、分离效果好、有机溶剂用量少、灵敏度高等特点，为保健食品中L-肉碱含量与纯度的测定提供了参考方法。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

超高效合相色谱仪（美国沃特世公司）；台式离心机（美国Thermo 公司）；AE260 电子天平（瑞士Mettler公司）；R215旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；超纯水净化系统（英国Elga公司）；MS2涡旋混匀器（上海医大仪器厂）；氮吹仪（日本东京理化公司）；微孔过滤膜（0.22µm，有机相）。

甲醇、乙腈、无水乙醇（色谱纯，西班牙Scharlau 公司）；碳酸氢钠（广东光华科技股份有限公司）；氨水（杭州高晶精细化工有限公司）；三氯甲烷、三乙胺（上海凌峰化学试剂有限公司）；氯甲酸丁酯（纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司）；L-丙氨酸-β-萘胺（纯度≥98%，上海安谱实验科技股份有限公司）；实验用水为超纯水；除特殊说明外，其他试剂均为分析纯。

肉碱外消旋体（纯度≥98%，美国Sigma 公司）。2 种对映体：L-肉碱（纯度为99.0%，德国Dr.E 公司）、D-肉碱（纯度为99.8%，美国CATO公司）。

1.2 标准溶液及试剂配制

1.2.1 外消旋体标准溶液肉碱储备液（1.0 g/L）：分别准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）肉碱外消旋体标准品，用无水乙醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液。

1.2.2 对映体标准溶液2种肉碱对映体储备液（1.0 g/L）：分别准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）左旋肉碱和右旋肉碱标准品，用无水乙醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液。

2 种肉碱对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准溶液，用无水乙醇逐级稀释成1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00 mg/L的混合工作溶液。

1.2.3 衍生试剂溶液及终止液的配制衍生试剂：称取0.45 gL-丙氨酸-β-萘胺，用乙腈溶解，并定容至100 mL。催化剂Ⅰ：称取0.50 g 三乙胺，加三氯甲烷混匀并定容至100 mL。催化剂Ⅱ：称取0.50 g 氯甲酸丁酯，加三氯甲烷混匀并定容至100 mL。反应终止液（50 mmol/L 碳酸氢钠溶液）：称取0.42 g 碳酸氢钠，加水溶解定容至100 mL。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取取20 粒保健品片剂、胶囊剂内容物或颗粒剂，研细，准确称取1.00 g（精确至0.01 g）样品置于烧杯中，加入适量无水乙醇，超声提取20 min，冷却至室温后转移至25 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，取适量定容液至离心管中，高速离心5 min后，所得上清液待衍生。

1.3.2 衍 生取0.5 mL 上清液至离心管中，加入0.5 mL 衍生试剂（4.5 g/LL-丙氨酸-β-萘胺乙腈溶液），涡旋混匀，依次加入0.5 mL 催化剂Ⅰ（5 g/L 三乙胺三氯甲烷溶液）和0.5 mL 催化剂Ⅱ（5 g/L 氯甲酸丁酯三氯甲烷溶液），涡旋混匀3 min，20 ℃衍生化60 min后，加入2 mL反应终止液（50 mmol/L 碳酸氢钠溶液），涡旋混匀1 min后，5 000 r/min离心5 min。移取上层水相于100 mL圆底烧瓶中，浓缩至近干，向浓缩瓶中加入1 mL无水乙醇，充分涡旋溶解，过0.22µm滤膜于进样小瓶。

1.4 分析条件

色谱柱：Acquity Trefoil CEL1（3.0 mm × 150 mm，2.5 µm，美国Waters 公司），填料为纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）；流动相：A为超临界CO2，B为氨水甲醇溶液（1∶99，体积比）。梯度洗脱程序：0～7 min，10% B；7～9 min，10%～28% B；9～12 min，28% B；12～13 min，28%～10% B；13～14 min，10%B。系统背压：13.8 MPa；流速：1.0 mL/min；进样量：5µL；柱温：40 ℃；检测波长：244 nm。

1.5 标准工作溶液的制备

分别精密移取0.5 mL“1.2.2”中2 种肉碱对映体的混合工作溶液于10 mL 离心管中，按照“1.3.2”方法衍生，制备成质量浓度为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L的标准溶液，相当于样品中含有25、50、100、250、500、1 000 mg/kg的2种肉碱对映体。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化

文献报道中通常采用乙腈［6－7］、无水乙醇［4］、甲醇［10］对肉碱进行提取。本文考察了上述3 种试剂的提取效果，在3 份不含左旋肉碱和右旋肉碱的保健品样品中添加肉碱对映体混合工作溶液，分别采用上述3种试剂进行提取，按照“1.3.2”方法衍生后上机检测。结果表明，采用乙腈、无水乙醇、甲醇的平均提取效率分别为13.4%、98.5%、70.3%。因此，实验采用无水乙醇进行提取。另外，实验对振荡和超声提取方式进行了比较，在2 份空白保健品样品中添加肉碱对映体混合工作溶液，分别采用振荡和超声提取方式进行提取，按照“1.3.2”方法衍生后上机检测。结果显示，振荡提取和超声提取的平均提取效率分别为54.5%和96.8%，因此选择超声提取。同时还考察了超声提取时间分别为10、20、30、60 min 时的提取效率，在4 份空白保健品样品中添加肉碱对映体混合工作溶液，超声提取不同的时间，按照“1.3.2”方法衍生后上机检测。结果表明超声提取10 min 时，2种肉碱对映体的平均提取效率为70.0%；延长提取时间至20 min时，平均提取效率为91.0%；超声提取时间增至30 min和60 min时，平均提取效率分别为91.8%和93.2%，2种肉碱对映体的提取效率并未显著增加。因此，实验确定最佳提取条件为超声提取20 min。

2.2 衍生条件的优化

本实验尝试用手性色谱柱将L-肉碱和D-肉碱直接分离测定，结果显示未衍生肉碱的仪器响应较低，分离度差，因此采用手性试剂衍生化法，生成2 种有极性差异且含紫外基团的衍生产物，从而实现2种肉碱对映体衍生产物的分离，该实验结果与文献［2，11］报道相符。氯甲酸乙酯［4］、氯甲酸丁酯［18］均可用作衍生反应的催化剂，因氯甲酸乙酯沸点低、毒性较强，且不易购买，故选用氯甲酸丁酯为衍生反应的催化剂。采用0.5 mL 催化剂进行实验，结果发现随着肉碱对映体质量浓度（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mg/L）的增加，衍生产物呈线性增加，说明0.5 mL 催化剂对于高浓度的肉碱对映体衍生反应也是完全的，故采用催化剂用量为0.5 mL。

考察了反应温度（4、20、40、60 ℃）对衍生反应的影响，吸取10 mg/L 肉碱对映体混合工作溶液0.2 mL于离心管中，反应时间为10 min。结果显示，反应温度从4 ℃升至20 ℃时，衍生产物逐渐增加；而当反应温度从20 ℃升至60 ℃时，衍生产物逐渐减少（见图1）。说明反应温度为20 ℃时，衍生产物含量最高，因此选择衍生反应温度为20 ℃。

图1 衍生温度对衍生反应的影响Fig.1 Effects of derivatization temperature on derivative reaction

考察了反应时间（10、30、60、90 min）对衍生反应的影响，吸取10 mg/L 肉碱对映体混合工作溶液0.2 mL于离心管中，反应温度为20 ℃。结果显示，随着反应时间的延长，衍生产物逐渐增加；当反应时间从60 min 增至90 min 时，衍生产物的增加不显著。因此选择衍生反应时间为60 min。实验比较了肉碱对映体衍生反应终止液（即萃取试剂）萃取次数对回收率的影响。向衍生反应溶液中依次加入2 mL反应终止液进行2 次萃取，结果显示，相比第1 次萃取的衍生产物，第2 次萃取的2 种肉碱对映体衍生产物增加不明显，因此实验采用2 mL衍生反应终止液进行1次萃取。

2.3 分离条件的优化

2.3.1 流动相中助溶剂的优化UPC2采用超临界二氧化碳为主要流动相，通常加入少量有机助溶剂调节流动相的极性，以增强对目标物的溶解能力和洗脱能力。为获得良好的峰形和分离效果，实验对有机助溶剂进行了考察。选择Acquity Trefoil CEL1 手性色谱柱（3.0 mm × 150 mm，2.5 µm），在背压13.8 MPa、柱温40 ℃条件下，比较了乙腈、甲醇、异丙醇3 种不同极性的助溶剂对肉碱分离效果的影响。结果显示，使用上述3种助溶剂时，2种肉碱对映体的分离度均不佳、峰形展宽明显，但甲醇作为助溶剂的分离度稍好。由于肉碱含有羟基，属于极性较强的化合物，加入氨水能够明显改善2 种肉碱对映体的峰形。进一步考察了不同体积比（0.1∶99.9、0.5∶99.5、1∶99）的氨水甲醇溶液作为助溶剂的分离效果。由图2可见，随着氨水含量的增加，2种肉碱对映体的峰形和分离效果得到明显改善，因此实验选择氨水甲醇溶液（1∶99）作为助溶剂。

图2 不同助溶剂对右旋肉碱和左旋肉碱分离效果的影响Fig.2 Effect of cosolvent on separation of D-carnitine and L-carnitine

2.3.2 系统背压的选择UPC2中，系统背压也是影响分离过程的重要因素，其主要作用是控制二氧化碳在整个操作过程中处于超临界流体状态。由于二氧化碳在温度超过31 ℃且压力超过7.38 MPa时才会进入超临界状态。因此本实验以氨水甲醇溶液（1∶99）作为助溶剂，在柱温40 ℃条件下，考察了背压分别为10.3、13.8、17.2、20.7 MPa 时2种肉碱对映体的分离效果。结果显示，随着系统背压升高，目标化合物的保留时间提前。当背压为10.3 MPa时，左旋肉碱的峰形展宽明显；背压升至13.8 MPa时，2种肉碱对映体的峰形良好，且在11 min内实现良好的基线分离；背压升至17.2 MPa时，2种肉碱对映体的分离度降低；背压继续升至20.7 MPa时，系统出现超压报警。综合考虑分离效果和分析速度，实验选择最佳系统背压为13.8 MPa。

2.3.3 色谱柱温度的选择在UPC2系统中，色谱柱温度主要通过影响流动相密度，从而影响目标物的分离效果。一般随着色谱柱温度升高，超临界流体密度变小，溶剂化能力降低，超临界流体对目标化合物的交换及溶解能力可能减弱，使得目标物的保留时间增大。考虑到Acquity Trefoil CEL1 手性色谱柱的最高推荐运行温度为40 ℃，且二氧化碳需在温度超过31 ℃且压力超过7.38 MPa 时才会进入超临界状态，因此本实验在系统背压为13.8 MPa下，考察了色谱柱温度分别为31、35、40 ℃时对目标物分离效果的影响。结果显示，随着柱温的升高，2 种肉碱对映体的分离度和色谱峰形均有改善，柱温为40 ℃时，2种肉碱对映体可实现基线分离。因此，实验确定最佳色谱柱温度为40 ℃。

按照上述优化的色谱条件进行拆分，如图3所示，右旋肉碱和左旋肉碱得到良好的分离。

图3 最佳条件下右旋肉碱和左旋肉碱的分离色谱图Fig.3 Separation chromatogram of D-carnitine and Lcarnitine under optimal conditions

2.4 稳定性的考察

分别准确移取7份0.5 mL的4.00 mg/L肉碱对映体混合工作溶液于7个离心管中，经衍生后转移至7 个带铝盖密封的进样小瓶中，用封口膜封好后于－20 ℃下保存，上机检测前再逐个转移至UPC2专用进样小瓶中。按照“1.4”色谱条件测定刚衍生化的以及已衍生化并分别储存1、3、5、7、14、30、60 d 的肉碱对映体标准溶液，30 d 内D-肉碱、L-肉碱含量的相对标准偏差（RSD）分别为4.4%、3.2%，60 d 内D-肉碱、L-肉碱含量的RSD 分别为10%、8.2%。采用T检验法比较刚衍生化与衍生后储存不同天数的肉碱对映体含量是否存在显著性差异。结果显示，2 种肉碱对映体衍生化后－20 ℃下放置30 d时p>0.05，在统计学上无显著性差异，表现良好的稳定性；－20 ℃下放置60 d时p<0.05，说明2种肉碱对映体衍生化后的溶液在60 d 时具有显著性差异。结果表明，2 种肉碱对映体标准物质衍生化后的溶液在规定条件下可保存30 d。

2.5 线性关系与定量下限

将衍生后右旋肉碱和左旋肉碱的系列混合标准溶液按上述色谱条件进行测定。以标准品的峰面积（Y）为纵坐标，对应质量浓度（X，mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，2 种肉碱对映体在0.50～20.00 mg/L 质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r2）大于0.999。通过在不含肉碱的保健品样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以10 倍信噪比（S/N=10）计算定量下限（LOQ），得到右旋肉碱和左旋肉碱的LOQ均为25 mg/kg。

2.6 准确度与精密度

分别在不含肉碱的固体类和液体类保健食品中添加标准溶液，左旋肉碱和右旋肉碱的加标水平均为25、50、250 mg/kg，平行测定6次，计算加标回收率及RSD。由表1可知，2种肉碱对映体的回收率为86.0%～110%，RSD 为4.3%～7.0%，符合SN/T 0001－2016［19］的要求，说明准确度和精密度能够满足不同剂型保健食品的分析要求。

表1 保健食品中2种肉碱对映体的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 2 kinds of carnitine enantiomers in health food（n=6）

2.7 方法应用

2.7.1 实际样品测定应用本方法对10 份市售保健食品中D-肉碱和L-肉碱的含量进行测定，其中片剂保健品5份，胶囊保健品2份，液体保健品3份。结果显示，10份保健食品中均未检出D-肉碱，片剂保健品和胶囊保健品中检出L-肉碱的含量为25.3～270.2 mg/g，液体保健品中L-肉碱的含量分别为144 g/L 和160 g/L，含量均达到标签值的96%～102%。欧盟规定L-肉碱的每日限量为1～2 g［20］，中国的L-肉碱用量主要参考欧盟规定，成人L-肉碱的食用量不应超过2 g/d［21］。所采购的10份L-肉碱保健食品的推荐服用量为0.12～1.8 g/d，均符合欧盟和中国规定的要求。

2.7.2 外消旋体标准品的拆分应用本方法对所采购的肉碱外消旋体标准品进行拆分及测定。结果显示，肉碱外消旋体含有D-肉碱和L-肉碱2 种对映体，以两者的峰面积之和作为100%，计算2 种肉碱对映体的占比，其中D-肉碱占肉碱外消旋体的51.2%，L-肉碱占肉碱外消旋体的48.8%。

3 结 论

本文优化了保健食品中肉碱对映体的前处理方法、衍生条件以及色谱分离条件，建立了超高效合相色谱拆分肉碱2种对映体及测定其在保健食品中含量的方法。考察了2种肉碱对映体标准品衍生产物的稳定性，同时还利用所建立的方法对肉碱外消旋体标准品和市售保健食品进行了测定。研究结果表明，本方法具有分析速度快、分离效果好、灵敏度高、绿色环保等特点，能够满足保健食品中左旋肉碱的快速定量及纯度分析需要。