超高效液相色谱－高分辨质谱非靶向快速筛查果蔬中农药残留

唐雪妹，陈志廷，黄健祥，谢书越，刘 帅，王 刚，万 凯*

（1.广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所，广东 广州 510640；2.国家农业检测基准实验室（农药残留），广东 广州 510640；3.广东农科监测科技有限公司，广东 广州 510640）

如今，食品安全问题越来越受到公众的关注，食品中未知污染物的存在对人类健康构成巨大威胁，因此开发非靶向分析方法以发现食品中潜在风险因子备受重视［1－2］。农药残留是影响农产品质量安全的重要因素之一，由于农药含量较低且大量干扰物质可与农药共萃取，对分析结果产生不良影响，因此复杂基质中农药多残留检测仍然是一项有挑战的工作［3］。开发农产品中非靶向农药残留分析方法对于保障农产品质量安全至关重要。

液相色谱与质谱联用正成为一种包括组学分析、环境分析和食品安全分析在内的许多领域的重要分析工具［4－6］。对于特定目标物的分析，三重四极杆质谱仪（Triple quadrupole mass spectrometer，QQQ）具有良好的定量性能，是目前常用的质谱仪。然而，QQQ 质谱通常仅限于分析已知化合物，难以在复杂的食物基质中检测和识别未知化合物［7］。高分辨质谱具有高分辨率和高质量精确度，已成为一种有效的非靶向筛查仪器，在各种食品基质中的不同有害物非靶向筛选中得到了广泛应用，如蔬菜水果［8］、畜禽水产［9－10］、茶叶［11］、中药材［12］等。农产品中风险因子的识别和确认往往需要采用准确质荷比（m/z）、保留时间（tR）、特征碎片离子、同位素比等信息，基于包含大量化合物信息的内部数据库以及结合Metlin、Massbank、Human Metabolome Database（HMDB）等在线数据库搜索加以判断［13］。然而受仪器参数、实验条件等影响，不同实验室开发的数据库难以实现通用，商业化数据库应用受到一定限制。

本研究开发了一种基于超高效液相色谱－高分辨率质谱（UHPLC－HRMS）的农药残留识别与确认的非靶向筛选策略。建立了简单、高效的样品预处理和分析方法，引用tR校准方法校正不同LCMS 下产生的保留时间，在原有商品化高分辨二级碎片谱图库的基础上，结合各国对农产品不同农药限量的实际情况，建立了651 种农药高分辨二级碎片谱图数据库，并选择其中的108 种典型农药作为代表进行本方法的评估验证。将该策略应用于果蔬农药残留的非定性筛查，取得了满意的筛选结果，为非靶向农药筛查打下了重要基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Q Exactive 高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技公司）；KQ－800 KDE 型高功率数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Multi Reax 自动涡旋仪（德国Heidolph 公司）；5804 R 离心机（德国Eppendorf 公司）；Milli－Q 超纯水仪（Merk Millipore 公司）；电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）。乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸、甲酸铵（HPLC 级，Aladdin 公司）；NaCl、无水MgSO4（分析纯，广州化学试剂厂）；PSA（50～60µm）、GCB（40～120µm）（迪马科技有限公司）。

1.2 农药标准溶液的配制

准确称取各农药标准品10 mg（精确至0.001 mg）于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，进一步用甲醇稀释成10 mg/L的标准溶液，－20 ℃贮存。

1.3 样品前处理

豇豆用不锈钢刀切成2 cm 大小的碎块，在不锈钢盆中充分混匀后以四分法分取200 g 左右，经组织匀浆机匀浆后装入样品袋中，于－20 ℃保存。

准确称取豇豆样品10 g（精确至0.001 g）于50 mL 离心管中，加入20 mL 1%乙酸乙腈，涡旋混匀2 min 后，加入2 g NaCl 和4 g 无水MgSO4，涡旋2 min，以5 000 r/min 离心5 min，取上清液1 mL，加入净化试剂（PSA 20 mg，无水MgSO4150 mg，GCB 2.5 mg，C1820 mg），涡旋混匀1 min，于5 000 r/min离心5 min；取上清液用0.22µm有机滤膜过滤，待液相色谱－高分辨质谱测定。

1.4 分析条件

色谱条件：水相为0.1%甲酸－5 mmol/L 甲酸铵的水溶液，有机相为0.1%甲酸－5 mmol/L 甲酸铵的甲醇溶液，A 为水相－有机相（98∶2，体积比），B 为有机相－水相（98∶2，体积比）。梯度洗脱：0～1 min，20% B；1～5.5 min，20%～90% B；5.5～11 min，90%～100% B；11～11.5 min，100%～0%B；11.5～12 min，0%B。进样量：5µL；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；Accucore aQ C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6µm）。

质谱条件：采用HESI 离子化方式；喷雾电压3.0 kV；毛细管温度325 ℃；加热器温度350 ℃；鞘气40 arb，辅助气10 arb；扫描模式为Full MS/dd－MS2，一级质谱扫描范围为m/z100～900，正离子采集模式；分辨率采用Full MS 70000 FWHM、dd－MS217500 FWHM、NCE：20、40和60。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 提取条件的优化非靶向筛查的目的是从样品中获取尽可能多的信息，因此前处理是样品分析过程中的关键步骤。快速预处理方法必须平衡大多数目标化合物的回收率并有效地除去额外杂质。本研究选择包含杀虫剂、杀菌剂、除草剂及植物生长调节剂等不同类型、极性跨度大的108 种农药作为典型代表，采用改进QuEChERS法对本方法的提取溶剂和净化剂进行优化。

在分散固相萃取方法中，通常采用乙腈或甲醇作为提取剂，为保证不同类型化合物的稳定性，往往需添加酸性、碱性或者缓冲盐等［14］。由于甲醇溶解能力更强，导致提取的杂质增多，因此本文比较了乙腈以及含0.1%、0.5%、1%乙酸的乙腈对豇豆样品的萃取效率。结果显示，90 种农药在中性和酸性乙腈条件下的提取回收率无明显差异，并满足定量实验的要求；而稻瘟灵和五氟磺草胺的提取回收率仅在酸性乙腈中满足要求，霜霉威、氟啶脲和仲丁威的回收率随着乙酸含量的增加而提高。据文献报道，乙腈中加酸可有效地保护一些不稳定的农药［15］。综合考虑，本实验选用含1%乙酸的乙腈作为提取剂，以满足98%农药的回收率要求（见表1）。

表1 108种代表性农药在不同提取剂中的加标回收率统计Table 1 Statistical analysis of recoveries of 108 representative pesticides with different extraction solvents

2.1.2 净化条件的优化与普通固相萃取法相比，QuEChERS法具有一定优势，常用PSA、C18和GCB等吸附剂进行基质净化［16－17］。其中PSA可有效消除有机酸、脂肪酸和样品中的碳水化合物，与C18结合使用可去除其他脂质和固醇类。GCB 对色素、多酚以及其他极性化合物具有很强的去除效果，但对平面结构农药存在一定的吸附作用，导致回收率降低。因此，本研究对比了不同净化剂配比条件下，典型农药在豇豆和柑橘中的加标回收情况。结果表明豇豆提取液颜色较深，有必要进一步纯化和去除色素，而选择2.5 mg GCB 能够很好去除色素并确保回收率，达到满意结果。与豇豆相比，柑橘基质含水量较高且含有高碳水化合物，色素含量较少，加入GCB 对目标化合物的吸附效果明显。进一步对净化剂的用量进行优化，研究表明深色蔬菜类选用20 mg PSA+20 mg C18+2.5 mg GCB+150 mg无水MgSO4净化剂组合时效果较好，而浅色多糖水果类选用20 mg PSA+150 mg无水MgSO4净化剂时效果较好。

2.1.3 色谱－质谱条件的优化通过实验比较，表明ThermoFisher Accucore aQ C18柱更适合多农药残留的分析。选择合适洗脱梯度，12 min 可完成样品的分析。采用双流动相梯度洗脱模式，考察了不同酸碱度以及缓冲盐条件下各农药的分离及离子化效率。本研究最终采用水（含0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸铵）与甲醇（含0.1%甲酸、5 mmol/L 甲酸铵）作为流动相，建立了UHPLC－HRMS 快速分析方法。在12 min 内，分离出108 种农药残留，提取的离子色谱（EIC）如图1 所示。可以看出，分析物的tR值在整个分析时间内均匀分布，且分析物能与共洗脱基质有效分离。

为选择最佳质谱参数以获得更灵敏、更准确的信息，本研究采用Full Scan/dd－MS2（TopN）质谱扫描模式采集数据。一级采用全扫描，二级采用数据依赖离子碎裂模式，所有化合物的碰撞能设置为梯度NCE，最终得到的二级质谱图是梯度能量下碰撞得到的质谱叠加图。有效地避免了由于不同实验室中轨道飞行仪器的单次碰撞能量差异而导致的低重现性，简化了碰撞能优化和质谱方法。

2.2 定性筛查与确证

2.2.1 保留时间的校正本研究引用保留时间（RT）校准方法来校正不同LC－MS 条件下产生的RT，并在原有商品化高分辨数据库基础上，结合各国对农产品不同农药限量的实际情况，建立了包含651 种农药的高分辨二级碎片内部数据库。保留时间校正法可克服不同仪器方法、不同采集序列的RT漂移，使不同实验室间的内部数据库得到广泛应用。选用11种相对稳定，保留时间在整个分析时段分布相对均匀的农药作为保留时间校正剂（RTcal），对不同洗脱梯度的RT 数据进行实验评价。RTcal混合物的提取离子流图分布如图2A所示，其在0～11 min时间跨度内均有分布。图2B展示了保留时间校准方法的原理示意图，该方法利用RT校正剂将整个色谱图划分为12个时间间隔，除了第一个和最后一个，其他10个时间间隔均包含两个RTcal。参照文献中保留时间校正公式［17］：

图2 保留时间的校正Fig.2 Correction of retention time

2.2.2 农药残留的非靶向筛查本文建立的包含651 种农药高分辨二级碎片内部数据库中的数据由保留时间校正方法和农药标准品测定获得。其中，一部分参数（包括农药名称、准确分子质量以及碎片离子信息）来源于商业化数据库，利用保留时间校正方法得到其在本文建立的分析条件下对应的保留时间，从而形成一套完整的数据库信息；另一部分参数来源于购买的标样在本文建立的分析条件下得到的保留时间、准确分子量以及碎片信息。将这两部分数据导入Tricefinder 数据分析软件从而建立包含651 种农药的数据库。在鉴定目标化合物时，未知物的筛查基于保留时间、前驱离子的质量准确度以及碎片离子和同位素峰丰度比匹配度等参数。依据欧盟标准2002/657/EC，高分辨定性方法只需母离子和1 个子离子匹配即可定性。TraceFinder 软件具有内置同位素模式评分系统和数据库搜索功能，并且评分过程绝对自动化和智能化，可提供大量化合物的快速常规筛查和鉴定。本文设定了以下定性参数：保留时间误差范围为± 0.5 min，质量准确度误差范围为± 5 ppm，同位素比匹配分数75 分以上，碎片离子匹配个数为1 个以上。本方法所建立的蔬果中农残非靶向定性筛查技术可满足方法学要求。

2.3 方法学考察

2.3.1 灵敏度与线性范围在优化条件下，采用本方法对质量浓度分别5、25、50、100、250、500µg/L 的108种农药的混合标准溶液进行测定，根据全扫描离子色谱峰面积（Y）与分析物的质量浓度（X，µg/L）建立标准曲线进行定量。结果显示，所有化合物的相关系数（r2）均大于0.99，表明质量浓度在5～500µg/L范围内与峰面积具有良好的线性关系（见表2）。参考欧盟SANTE/12682/2019规定，检出限（LOD）为3倍信噪比（S/N）的浓度，定量下限（LOQ）为具有可接受回收率（70.0%～120%）且相对标准偏差（RSD）<20%的最低添加浓度，测得本方法的LOD为0.002～1.5µg/kg，LOQ为5µg/kg（详见表2）。

表2 108种农药的检出限、定量下限、相关系数（r2）、回收率及相对标准偏差Table 2 LODs，LOQs，correlation coefficients（r2），recoveries and RSDs of 108 pesticides

2.3.2 回收率与相对标准偏差为评估分析方法的回收率与相对标准偏差，将不同质量浓度的108种农药混合标准溶液添加到空白豇豆和柑橘样品中进行加标回收实验和基质影响的研究，加标水平分别为5、25、100µg/kg，每个水平重复5个样品，以溶剂空白和样品空白作为对照。结果表明，除了灭蝇胺和矮壮素以外，蔬菜和水果中106种农药的加标回收率分别为61.2%～117%和61.3%～120%，相对标准偏差（RSD）分别为0.1%～9.9%和0.1%～9.9%。表明该方法的准确性和精密度满足农药残留的分析要求。

（续表2）

（续表2）

2.4 实际样品的分析

应用本方法对58批次豇豆样品和12批次柑橘样品进行快速筛查和定量分析。豇豆样品筛查出的农药主要为灭蝇胺（检出率48.3%）、苯醚甲环唑（检出率22.4%）、吡唑醚菌酯（检出率22.4%）、啶虫脒（19.0%）等，其中灭蝇胺未在豇豆上登记使用，超范围使用易导致产品不合格。柑橘样品中筛查出杀虫剂吡虫啉和保鲜杀菌剂咪鲜胺、苯醚甲环唑、戊唑醇等，含量均低于国家规定的最大残留限量值，安全风险较低。实验结果表明本方法适用于蔬菜水果中农药残留的筛查分析。

3 结 论

本文利用UHPLC－HRMS 建立了果蔬中农药残留快速筛查和定量分析的方法，并应用于实际样品的筛查。引入的保留时间校正法可有效地利用不同实验条件下获得的数据库，拓宽液相色谱－高分辨质谱数据库的适用范围，提高定性筛查的准确性。本方法简单、可靠，应用于大量样品的快速筛查和定量，表现出良好的性能，满足农产品中非定向农药的快速筛查与定量分析，为保障农产品质量安全提供了技术支撑。