曲唑酮对青春期雄性大鼠神经行为的影响及其相关机制研究

曲唑酮（trazodone）是一类经过FDA批准的抗抑郁症药物，属于5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受体拮抗剂和再摄取抑制剂，可拮抗5-HT的Ⅱ型受体，还可发挥抗胆碱作用

。另有研究发现，曲唑酮除了具有抗抑郁活性，其对失眠、焦虑、创伤后应激障碍（PTSD）和强迫症等多种精神疾病具有治疗效果

。由于抑郁、失眠、焦虑等疾病均会影响患者的认知功能

，对患者的日常生活和工作等造成困扰，因此需要对抑郁等疾病中认知功能发生改变的原因进行探索并寻找解决方案。5-HT是脑内一种重要的神经递质，若5-HT水平降低，神经元间的信息交流会出现延缓，其水平减少直接与精神、情绪、行为变化有关；MAPK蛋白与神经障碍密切相关，ERK1/2及p38MAPK是MAPK家族蛋白，ERK1/2可通过突触调节神经元重塑及可塑性，p38MAPK在应激下被激活，对神经可塑性及中枢神经系统发育具有重要作用

；c-fos基因表达是神经元激活的标志，其可作为情感、神经损害、行为改变的一个重要标志，5-HT可通过刺激神经元MAPK蛋白、c-fos基因来影响脑部神经功能

，因此我们推测5-HT受体拮抗剂曲唑酮可能对青春期雄性大鼠认知功能产生影响，同时选择MAPKERKP38、c-fos基因表达作为观察指标，分析曲唑酮的作用机制，从而为临床上曲唑酮在神经行为中的应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠32只，7～8周龄，体质量280～320 g，购自南京模式动物生物有限公司，均饲养于动物房鼠笼，12 h/12 h明暗交替循环，温度20～22 ℃，湿度50%～55%。

1.2 动物分组 将大鼠按照随机数字表分为4组：对照组、曲唑酮低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组8只。用生理盐水配制曲唑酮溶液，低、中、高组依次给予10 mg/kg、20 mg/kg和50 mg/kg曲唑酮溶液腹腔注射，对照组腹腔注射等量生理盐水，连续14 d。

公共艺术作为公共空间中的艺术形态，不仅以重要的人文景观，起着协调环境、发挥公共空间亲和力和审美趣味提升的作用，还以一种特殊的形式提醒大众合理处理人与自然的正常而和谐的关系，在人与自然环境之间建立一种平衡。当然，科学发展观指导下的科学和技术，在合理利用、开发和保护自然方面发挥着主导的作用，但是，艺术在修复人与自然的关系、创造人与自然的新关系方面也有着不可忽视的力量。艺术家在开放的、较大空间区域里，通过对空间的重新构架、特殊材质运用、造型与色彩的奇妙组合、AR HR等新媒体的应用，等一系列艺术创作手段，创造出人与自然和谐关系的公共艺术作品，警示自然环境对人类生存与发展的重要性。

1.3 旷场实验

连续注射曲唑酮14 d后进行旷场实验，实验所采用的旷场箱大小为100 cm×100 cm×40 cm，用黑线将底面划分成25个小正方格，每个正方格为20 cm×20 cm。将周边的16个正方格记为外周格，位于中央的9个正方格称为中央格。在正中央方格上方安置高像素摄像头。实验在安静的环境下进行。将大鼠放入场地中央自由活动10 min，为预适应阶段。测试阶段：将大鼠面朝墙放入同一个拐角方格，并让其自由探索环境5 min，同时进行摄像和计时。结束后清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息（动物的大、小便、气味）影响下次测试结果。更换动物，继续实验。分析每只大鼠在旷场中的总路程和进入中央格的次数、在中央格的停留时间。

1.4 强迫游泳实验

旷场实验结束后进行强迫游泳实验，于正式实验前24 h将测试大鼠放入装有25 ℃水的透明玻璃缸（1.5 m×1 m×0.5 m）中，室温25 ℃，大鼠悬浮四肢不能触及桶底，15 min后将大鼠取出、擦干后放回笼中；次日在同样的条件下进行强迫游泳5 min，记录5 min内大鼠静止不动时间（大鼠仅有头部露出水面，身体飘浮在水中，四肢可有微动但不挣扎），测试过程采用摄影机记录，采用荷兰Noduls公司强迫游泳分析软件分析数据。

曲唑酮是第二代抗抑郁药物，一般认为它与传统的抗抑郁药物不同，因为曲唑酮基本对单胺类递质的氧化性不产生影响，对去甲肾上腺素再摄取过程的作用也微乎其微

。而曲唑酮对于5-HT能神经元系统的作用也较为复杂。在体内外实验中，曲唑酮被发现可以选择性抑制5-HT转运体，但是它抑制5-HT转运体的能力相比选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRIs）较弱，只有持续给予曲唑酮处理才可以达到SSRIs的抑制效果

。曲唑酮剂量的选择是因为其常规剂量为10 mg/kg，而孟德轩等研究发现大剂量20 mg/kg曲唑酮对脑卒后抑郁大鼠的空间学习及记忆功能的影响最佳

，本文以20 mg/kg作为中剂量，以50 mg/kg作为大剂量进行了分析，以判断是否增加曲唑酮剂量仍可增加青春期雄性大鼠神经行为的影响效果。

染色前将玻片晾干，0.5% Triton溶液室温破膜15 min，用1∶20驴源溶液在室温封闭1 h，加入一抗，置于湿盒中4 ℃过夜，经过PBS润洗3次（5 min/次），室温孵育二抗2 h，继续用PBS润洗3次（5 min/次），弃去液体，用含DAPI的封片液（Sigma-Aldrich，USA）进行封片。采用共聚焦（Olympus FV1000，Japan）进行拍摄成像。所用一抗为：c-fos（1 ∶400，Vector Laboratory，USA）；NeuN（1∶300，Abcam，USA）。

随着收藏市场上邮品拍卖热度不减，收藏不同版式的邮票，不仅增加了收藏市场集藏的乐趣与多样性，也是邮品日后增值的一个有力保证。为此，集邮爱好者在关注邮票内容的同时，还需要在邮票版式方面多做研究。时下相关题材邮品众多，集邮爱好者选择收藏时，需要注意收藏重大纪念事件方面的邮票。不过业内人士提醒广大收藏投资者，早期邮品的品种较多，而且个别品种的存世量也较大，如果要全部进行收集，难度是比较大的，因此，收藏投资者可按自己的实力、兴趣选择某个年代作为收藏投资对象。

1.6 免疫组织化学染色 在水迷宫实验结束后进行免疫组织化学染色，随机选取对照组、曲唑酮低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠各4只，用生理盐水进行心脏灌流，用4%多聚甲醛在4 ℃固定过夜，30%蔗糖溶液脱水至沉底。用冰冻切片机（Leica，Germany）将大鼠脑切为30 μm厚度切片，室温晾干后保存于－80 ℃。

1.7 Western blot 在水迷宫实验结束后进行Western blot实验，选择剩余对照组、曲唑酮低剂量组、曲唑酮中剂量组、曲唑酮高剂量组大鼠各4只，将大鼠用10%戊巴比妥钠麻醉，断头，在冰上剥离脑组织并分离前额叶皮层区域脑组织。用添加蛋白酶抑制剂 （1 μg/mL Laprotinin，1 μg/mL leupeptin，1 μg/mL pepstatin A） 的RIPA （10 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，0.5%Nonidet P-40）进行组织块裂解，12 000 g 离 心10 min，用蛋白定量检测试剂盒（Pierce，美国）对总蛋白浓度进行定量分析。提取20 μg蛋白样本用SDS-PAGE凝胶分离，转膜至PVDF膜（Bio-Rad，美国）上；将条带用4% BSA进行封闭，一抗在4 ℃孵育过夜，二抗室温1 h，采用化学发光仪（Tanon，中国）进行条带拍摄。

Stability analysis and treatment of Toudaohe landslide in the Three Gorges Reservoir Area

通过对青春期雄性大鼠腹腔给予不同剂量曲唑酮溶液，联合对照组，进行了旷场实验、强迫游泳实验和水迷宫实验分析了大鼠的行为，对大鼠的脑组织进行Western blot分析和免疫组织化学染色分析，本研究发现给大鼠腹腔连续注射14 d 20 mg/kg曲唑酮，可以显著增加大鼠在水迷宫中的空间学习记忆能力、降低大鼠的焦虑和抑郁水平，其中机制可能与曲唑酮抑制前额叶皮层MAPK信号通路、抑制5-HT神经元活性有关。

2 结果

2.1 曲唑酮对大鼠的焦虑水平和抑郁水平的影响 与对照组以及低、高剂量组相比，中剂量组大鼠在旷场箱中运动总路程（

＝20.452，

＜0.001；

＝15.280，

＜0.001；

＝8.446，

＜0.001） 和中央格停留时间（

＝11.971，

＜0.001；

＝10.658，

＜0.001；

＝14.963，

＜0.001） 均显著增加，低剂量组较对照组显著增加 （

＝5.62，

＜0.001；

＝3.546，

＝0.003），高剂量组与对照组以上两个指标相比差异无统计学意义（

＞0.05）；各组大鼠进入中央格次数比较，仅对照组和中剂量组相比差异具有统计学意义，中剂量组较对照组显著增加（

＝2.696，

＝0.017），其余分组相互比较差异无统计学意义（

＞0.05）；与其余三组比较，中剂量组在水中不动时间显著降低（

＝3.017，

＝0.009；

＝2.8，

＝0.013；

＝2.523，

＝0.03），而该三组相比差异无统计学意义（

＞0.05），见表1。

2.3 曲唑酮对大鼠5-HT神经元活性的影响 相比对照组以及低、高剂量组，中剂量组大鼠NeuN 标记的神经元表达c-fos 的比例显著降（

＝2.483，

＝0.042；

＝3.781，

＝0.007；

＝2.388，

＝0.048），而对照组、低、高剂量组相互比较差异均无统计学意义（

＞0.05），见表3。

2.2 曲唑酮对大鼠空间学习记忆能力的影响 相比对照组以及低、高剂量组，中剂量组大鼠在平台所在象限停留时间（

＝10.671，

＜0.001；

＝13.921，

＜0.001；

＝6.902，

＜0.001）和穿越次数（

＝5.601，

＜0.001；

＝3.685，

＝0.002；

＝3.15，

＝0.007）均显著增加，而对照组、低、高剂量组相互比较差异均无统计学意义（

＞0.05），见表2。

2.4 曲唑酮对大鼠MAPK信号通路的影响 相比对照组以及低、高剂量组，中剂量组大鼠p-ERK/ERK（

＝3.332，

＝0.013；

＝2.476，

＝0.042；

＝2.886，

＝0.023） 和p-P38/P38表达水平（

＝4.378，

＝0.003；

＝9.148，

＜0.001；

＝3.385，

＝0.012） 均显著降低，而对照组、低、高剂量组相互比较差异均无统计学意义（

＞0.05），见表4。

奶奶走的时候，一再交代母亲不要将镯子随她带进泥土，好给后人留个念头。其实在她内心是不舍的，奶奶相信轮回转世，这镯子是她和爷爷的唯一信物。冥冥中，我似乎感知到，这对镯子，虽没有钻石珠宝金贵，却承载了太多刻骨铭心的往事，它是名副其实的无价之宝，它正激励我要为家庭责任和家族的延续而奋斗不止。

3 讨论

1.5 水迷宫检测

强迫游泳实验结束后进行水迷宫检测，将每组大鼠放回至原笼位饲养1周，降低大鼠的应激反应，再进行水迷宫实验。Morris水迷宫设备是一个圆形的水箱，里面装满了水，加入钛粉使水变成白色。水迷宫直径为120 cm，高50 cm，水温22～24 ℃。在整个实验过程中，在水箱的1象限，在水面下1 cm处隐藏一个平台（直径为16 cm）。在每一项实验中，让大鼠在60 s内找到隐藏的平台；如果未能在60 s内找到平台，则手动引导大鼠到隐藏的平台，并在那里停留30 s。在手术前连续4 d每天进行4次训练试验。在每一次试验中，都要计算大鼠寻找到平台的时间，即潜时，和大鼠的游泳速度。训练结束后，移除隐藏平台测试空间记忆。在此项研究中，移除平台，计算大鼠通过平台所在象限的次数和在目标象限花费的时间。所有数据采集通过视频跟踪系统获得。

所用一抗：p-P38 （1 ∶500，Merck Millipore，Germany）；P38 （1 ∶500，Santa Cruz，USA）；p-ERK（1 ∶500，Santa Cruz，USA）；ERK （1 ∶500，Cell Signaling Technology，USA）；GAPDH（1 ∶1 000，Cell Signaling Technology，USA）。

尽管曲唑酮的抗抑郁效果相比其他药物较弱，但是在一些临床研究中发现，曲唑酮还有多方面的好处。它能对患者的睡眠产生积极影响，增加睡眠周期中慢波睡眠（SWS）的时间，延长快动眼（REM）起始时间，有多项研究探索了曲唑酮对失眠症的影响

。曲唑酮还能对焦虑产生一定影响，是应对PTSD的有效药物，其中机制可能与曲唑酮能增加患者睡眠有关。

为确保在极端工况、防喘振控制系统或阀门定位器等故障情况下也能保护机组,在喘振线与控制线之间设置了一条流量下限安全线（FAL）,当运行点到达安全线（FAL）时,旁路阀快速打开，提高入口流量，同时DCS上将旁路阀阀开度锁定在100%上，入口导流叶片阀开度锁定在0%上，压缩机卸载。

在旷场实验中，当大鼠出现焦虑心理时，大鼠会对旷场这个新环境表现出恐惧和探究的矛盾心理，焦虑越严重的大鼠越倾向沿外周格活动，焦虑情绪越低的大鼠，会在旷场中表现出明显的探索行为，即进入中央格的次数会增多、在中央格的活动时间也较长。在强迫游泳实验中，由于大鼠厌恶水，会在装水的玻璃杯中游动，而抑郁的大鼠会在水中停止不动，通过统计大鼠的不动时间，可以分析大鼠的抑郁情况。在本研究中，我们发现只有在给予大鼠20 mg/kg曲唑酮后，其焦虑水平和抑郁水平相比对照组降低，而在低剂量和高剂量并未产生显著抗焦虑和抑郁水平，这可能与曲唑酮的副作用有关，在高剂量情况下，曲唑酮会持续抑制钾离子、钙离子等偶联的离子通道，引起包括心脏毒性等的副反应

。

（1）在现代机械制造工艺的发展中，市场经济发挥着至关重要的作用。现代机械制造工艺更具有市场化，其所包含的包装以及运输等等都是为了满足市场经济的需求。

由于焦虑、抑郁等疾病常伴有认知功能下降，曲唑酮是否能对认知功能产生影响，目前有较多争议。在一些额颞叶痴呆和AD患者中，曲唑酮被发现可以对患者的认知功能起到较好的干预效果

，包括促进患者的行为平衡能力和减少患者的攻击行为等。而在另一项研究中发现，不论是单次给药还是连续长期给药，曲唑酮都不会对被实验者的认知功能产生影响

。在本研究中，我们通过水迷宫对大鼠的认知功能进行测试，发现低、高剂量也不会对大鼠的认知功能产生影响，而在中剂量组，曲唑酮可以增加大鼠对原平台位置的探索，提示大鼠具有较高的记忆能力。以上结果均表明曲唑酮可以对青春期雄性大鼠的认知功能产生积极影响，但是其作用与给药剂量密切相关。c-fos作为MAPK信号通路的下游蛋白分子，在病理情况下，其表达水平显著上升表明神经元过度激活，通常会介导脑组织的损伤过程

。本研究表明：经中剂量曲唑酮干预后，c-fos阳性神经元数量显著下降，分析其原因在于：c-fos基因可受5-HT诱导上调

，而曲唑酮可拮抗5-HT的Ⅱ型受体，因此大鼠5-HT神经元活性显著降低。另外MAPK信号通路分子ERK和P38的磷酸化水平降低，表明：曲唑酮可以通过调节MAPK信号通路，抑制前额叶皮层5-HT神经元活性，可一定程度减轻大鼠的脑损伤，促使其神经功能改善。此外5-HT与动物的焦虑、认知等神经行为密切相关

，结合本研究结果：长期服用曲唑酮对睡眠障碍和情绪障碍具有治疗作用，其机制可能与药物影响动物5-HT代谢有关。

本研究也存在一些不足之处：首先，前额叶皮层虽然有大量的5-HT神经元，但是也有其他如胆碱能神经元，而曲唑酮具有较弱的抑制胆碱能神经元的作用，因此，不能排除在本研究中，曲唑酮对胆碱能神经元的调控作用及其贡献。在之后的研究中，我们将会通过对胆碱能神经元和5-HT神经元分别进行特异性抗体染色，以区分曲唑酮通过不同神经元对中枢神经系统的调控作用。总之，本研究通过不同剂量曲唑酮，探索了其对青春期雄性大鼠神经行为的影响，发现曲唑酮可以降低大鼠的焦虑、抑郁水平，提高认知能力，其中中剂量组作用效果最好，这一过程可能与抑制MAPK信号通路活性、抑制5-HT神经元活性相关。

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