植物中黄酮类化合物提取技术研究进展

景联鹏，唐徐禹，顾丽莉，尚关兰，李瑞东，李增良，朱毓航

（1.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500；2.云南烟叶复烤有限责任公司，云南 昆明 650021）

黄酮类化合物是以C6-C3-C6为基本骨架，即两端为芳香环，中间以C3链互相连结而成的一种天然化合物，主要有黄烷醇类、二氢黄酮、异黄酮类、查尔酮和花色素类等种类。在自然界中，绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，以芸香科、菊科、伞形科、苦苣苔科及豆科植物居多，在植物体内小部分以游离态（苷元）形式存在，大部分是与糖类结合形成苷类，以配基形式存在。研究得出，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基和抗辐射等作用[1]。然而黄酮类化合物不能在人体内直接合成，只能通过食物或药物摄取，现今具有黄酮类食品添加剂的保健食品需求日益增加，相关药物制备对黄酮类化合物的种类和纯度有更高要求，因此，针对不同天然植物中所含黄酮类化合物的种类和含量不同，其分离提取研究就有了非常重要的意义。

1 黄酮类化合物提取技术

近些年来，提取黄酮类化合物的技术逐渐趋于多样化，包含单一提取法、辅助提取法和多种方法的耦合提取，其发展历程见图1 所示。在黄酮类化合物的提取研究中，主要以单因素（提取时间、溶剂种类及用量、提取温度等）影响为基础，进而采用正交试验或响应面分析法确定最佳工艺参数，使黄酮类化合物的提取率最大化。

图1 黄酮类化合物提取技术的发展历程

1.1 单一提取法

1.1.1 热水提取法

大多数黄酮类化合物因具有酚羟基，易溶于热水，故可用热水提取，但仅限于黄酮苷类物质。1998 年，胡敏等[2]采用热水浸提银杏中黄铜苷，实验表明，90℃水回流提取2 次，每次4 h，将提取液经反复过滤和浓缩后，用树脂精制，最后冷冻干燥，所得银杏提取物中总黄酮苷含量为25%（wt），最高可达40%（wt），高于当时国内外文献报道的水平。何明祥[3]利用热水法从仙草中提取总黄酮，得出提取时间和料液比对黄酮的提取率影响较大。虽然热水提取法操作简单，溶剂无污染，成本低，但由于提取率较低，周期较长，并可将易溶于热水的杂质（如无机盐、蛋白质、糖类等）一并提取，从而降低黄酮类化合物的纯度，纯度低导致后续可能需要更多的纯化步骤，而纯化过程操作繁琐和耗费时间是该技术本身的缺陷，目前单一的热水提取法已经极少使用。

1.1.2 碱溶酸沉法

黄酮类化合物大多具有酚羟基，酚羟基呈弱酸性，易溶于碱水或碱性稀醇；另外，黄酮母核遇碱开环，溶解度增大，遇酸后析出沉淀，故可利用黄酮类物质与杂质在酸碱性溶液中溶解度差异进行提取，该工艺简单，成本较低，浸出能力强，但容易浸出杂质，不利于后续纯化。刘金香等[4]采用氢氧化钠提取银杏中的总黄酮，考虑了pH 值、固液比、提取温度和提取时间对实验的影响，通过极差分析得知各因素对提取效果的影响顺序为：pH＞提取时间＞固液比＞提取温度，在最佳实验条件下总黄酮提取率平均为86.4%。Li 等[5]用该法提取龙眼籽中黄酮类物质，结果发现，得率和纯度受到蛋白质和碳水化合物沉淀物等杂质的影响。

1.1.3 有机溶剂提取法

利用有机溶剂对各类物质溶解度的差异，从植物中提取有用成分已经十分普遍。针对黄酮类物质常用醇类溶剂（如乙醇和甲醇）作为提取剂。例如，黄酮苷类可用60%（V/V）左右醇提取，而黄酮苷元则可用90%～95%（V/V）醇提取。赵象忠[6]用65%（V/V）乙醇提取人参果中的黄酮，当料液比为1∶20，浸提温度70℃，pH 为5 时，黄酮提取率高达0.493%。Liu 等[7]优化了黄芩中总黄酮的提取工艺，确定了提取条件：52.98%（V/V）乙醇，提取2.12 h，提取温度62.46℃，液固比35.23，黄酮提取率为1.943 7%。于海莲[8]以甲醇为溶剂提取仙人掌中黄酮类化合物，各因素的影响大小依次为：时间＞温度＞甲醇浓度＞料液比，最佳条件下提取率为0.741%。

1.1.4 绿色溶剂提取法

有机溶剂通常不可再生，且易燃、易挥发、有毒、污染环境，当今社会对环境问题极为重视，由此寻找一种绿色提取技术逐渐成为天然产物提取分离的研究热点。Chemat 等[9]对“绿色提取”进行了初步阐述：能源消耗低、溶剂可替代、资源可再生、提取物或产品安全且质量可靠。Huang 等[10]研究了由天然组分制备的十三种天然低共熔溶剂的粘度、极性和溶解性等基本物理性质。结果表明，芦丁在氯化胆碱和甘油基组成的低共熔溶剂中的溶解度最高，与水相比，增加了660～1 577 倍。Meng 等[11]采用低共熔溶剂，以超声为辅助从蒲黄中提取黄酮类化合物，并以槲皮素、柚皮素等活性成分为指标，对比了常规有机溶剂（甲醇和75%乙醇）的提取效果。结果显示，使用低共熔溶剂提取效率更高。

1.1.5 超临界流体萃取法

超临界流体萃取法溶剂和溶质易分离，且活性成分和热不稳定成分不易被分解可保持其天然特征[12-14]，但该法主要应用于弱极性天然产物和手性异构体物质的分离，针对极性物质，可加入极性夹带剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）改变溶剂的极性，扩大该方法的适用性，但找到好的夹带剂是关键。潘利华[15]采用超临界CO2萃取脱脂豆粕中染料木苷，当乙醇用量300 mL/100 g 脱脂豆粕，温度55℃，压力30 MPa，静萃取2 h，动萃取1 h，染料木苷萃取率为794.5 μg/g。刘雯等[16]探讨了夹带剂加入方式（预浸、预浸＋动态萃取、预浸―静态萃取＋动态萃取）在超临界CO2萃取银杏叶总黄酮醇苷中的影响，结果表明：采用预＋动态萃取模式，总黄酮醇苷提取率最高，为超临界CO2萃取夹带剂的加入方式提出了一个全新的思维方法。

1.1.6 亚临界萃取法

亚临界萃取是以低沸点有机物作为萃取剂，在低温减压条件下进行蒸发分离，其分离条件温和，能保持萃取物生物活性，且萃取剂可重复使用，在分离提纯领域有广泛的应用前景。2016 年，王静等[17]首次利用亚临界萃取技术萃取荨麻草中黄酮类化合物，结果显示：在液料比1.5∶1，温度45℃，压力0.3 MPa 下萃取1.5 h，黄酮获取率为3.835%，该试验条件环保，并且产物也能够保持较好的生物活性。Kim[18]研究了亚临界水在不同温度和流速下控制柑桔皮黄酮类化合物提取率的机理，提取速率曲线表明双位点动力学模型对整个提取过程拟合良好，柑橘黄酮类化合物的提取主要受颗粒内扩散控制。Wang 等[19]建立了用亚临界乙醇从辣木叶中提取黄酮类化合物的大规模工艺流程，在最佳条件下黄酮类化合物的最高收率可达2.60%，时间仅需2 h，与传统的乙醇回流法相比，收率提高了26.7%，且节能效果明显。

1.1.7 双水相提取法

双水相体系（Aqueous Two-Phase System,ATPS），通常是指两种亲水性化合物的水溶液在一定浓度下混合后自发形成两个互不相容的水相体系，其分离原理是利用物质在双水相体系中的选择性分配从而达到分离目的。Zhang 等[20]选择以28%（V/V）乙醇和22%（wt）K2HPO4组成的双水相体系提取木豆根中染料木素和芹菜素，经分析得出染料木素和芹菜素的回收率分别为93.8%和94%，且ATPS 提取物具有较高的抗氧化活性。Liu 等[21]采用乙醇―无机盐体系对金银花中黄酮类化合物进行提取纯化，研究表明，提高盐浓度或乙醇含量，可以提高顶部相的黄酮含量，在最佳条件下，萃取一次的总黄酮回收率为98.56%，纯度为8.86%，经过二次萃取后，纯度能达到22.88%。

1.1.8 半仿生提取法

半仿生提取法（Semi-bionic Extraction Method,SBE），最初由孙秀梅、张兆旺等[22-23]提出，该法整合了整体药物研究法与分子药物研究法，具有周期短和保护药物有效成分等优点。通常半仿生技术以水为溶剂提取总黄酮，但会导致多糖、淀粉、原聚糖等杂质的产生，增加后续分离纯化的难度。Lai[24]以乙醇代替水，通过半仿生技术提取紫藤中的总黄酮，在最佳条件下，总黄酮得率为4.73%，该法具有渗透性强、选择性好、浸出率高等优点，有效减少了产物中的杂质。薛璇玑等[25]以浸膏质量和黄酮含量为指标，对乙醇回流法、酶法、半仿生法和半仿生酶法在柿叶中总黄酮的提取效果进行了比较，通过正交试验分析得出，以半仿生酶法效果最佳，其次为半仿生法、酶法和乙醇回流法。Xiao[26]研究了超声波辅助半仿生提取半枝莲总黄酮的最佳工艺，当超声功率60 W，时间30 min，固液比1∶30（g/mL），乙醇浓度60%，温度60℃，总黄酮的提取率为3.01%，实验表明该法适合提取半枝莲中总黄酮，为黄酮类药物及抗肿瘤中药半枝莲的开发利用提供了重要依据。

1.2 辅助提取法

1.2.1 蒸汽爆破辅助提取

蒸汽爆破的原理是将蒸汽加热到180～235℃，压力维持数秒到数分钟后，渗进植物组织内部的蒸汽分子瞬间释放，由此蒸汽内能转化为机械能并直接作用于植物组织，使其结构遭到破坏，利于植物成分的提取，该法能耗低、绿色环保且高效[27]。Qin 等[28]利用蒸汽爆破辅助提取无花果叶中黄酮类化合物，与未经蒸汽爆破处理相比，提取物中黄酮类化合物产量高出55.9%。魏锦锦等[29]以蒸汽爆破预处理杜仲皮，使得植物胞间质变得疏松，破坏了杜仲皮复杂的结构，打开了活性成分溶出的通道，促进了黄酮的溶出。Dorado等[30]采用静态蒸汽爆破法分离柑桔汁加工废料中的糖类、黄酮类化合物，考虑了静态反应器的温度和保持时间对分离效果的影响，结果显示，当温度为170℃，保持时间8 min，可最大限度地增加提取液中糖和黄酮的含量。

1.2.2 脉冲电场辅助提取

脉冲电场（Pulsed Electric Field,PEF）是一种新兴的非加热型处理技术，其作用机理为：介于2 个电极之间的样品材料，受到短时重复高压脉冲电场的冲击，使得细胞质膜的渗透性增强，从而使胞内物质快速流出，提高提取效率。Elisa 等[31]利用PEF 技术辅助提取橘皮中的抗氧化成分（柚皮苷、橙皮素等），并设置无脉冲电场为对照组，实验表明，当电场强度为5 KV/cm，脉冲频率20 个/60 μs 时，提取液中柚皮苷含量为3.1 mg/100 g，橙皮素含量为4.6 mg/100 g，分别是对照组的3.1 倍和3.5 倍，同时提取物的抗氧化活性也增强了148%。Siddeeg 等[32]研究了PEF 对枣果提取物中生物活性成分、抗氧化活性及理化性质的影响。结果表明，用PEF 处理果实，电场强度对黄酮类化合物的总含量有积极的影响，但对提取物的电导率、pH 值和可滴定酸度影响甚微，与未经PEF 处理的样品相比，提取物具有更强的抗氧化活性。

1.2.3 超声波辅助提取

超声波的机械效应、空化效应、乳化、扩散、击碎、化学效应和热效应等使植物细胞壁及整个生物体破裂，且整个破裂过程在瞬间完成，有利于植物中有效成分的释放与溶出，并且能保证有效成分的结构和生物活性不变，有效提高了有效成分的提取率和原料的利用率。李烨等[33]优化了超声波提取竹叶黄酮的工艺参数，为车间中试和企业生产提供了一种基于超声波提取的耗时短、能耗小、操作简单的方法。Ji[34]采用超声法提取红花酊中的黄酮，并采用紫外分光光度法测定其含量，结果表明：红花酊中黄酮类化合物的含量为20.6 mg/g，相比无超声波辅助情况，提取时间更短，能耗更低。

1.2.4 微波辅助提取

微波是频率介于300 MHz～30 GHz 之间的电磁波，利用黄酮类物质与杂质对微波的吸收能力差异，可用微波辅助对其进行提取。磁控管所产生的超高频率的快速震动使样品内分子间相互碰撞和挤压产生热能，物质的介电常数越大，产热越大，产生的热量使细胞内部温度迅速上升,细胞中的水分汽化将细胞涨破，以此促进样品中有效成分的浸出。柳迪等[35]建立了微波辅助乙醇法提取胶囊类保健食品中总黄酮的提取工艺：当提取时间30 min，液料比80∶1（mL/g），70%（V/V）乙醇时，黄酮提取率达到4.52%，为提取保健品中的黄酮提供了新的思路。Mangang 等[36]以最大限度地保留树皮中生物类黄酮为目标，通过响应面分析得到最佳提取参数：功率728 W，液固比24.70 mL/g，时间40 min，70%乙醇，生物类黄酮最大提取率达1.527 4%。

1.2.5 酶解辅助提取

酶作用能充分破坏植物的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶，使果胶完全分解成小分子物质，减小提取的传质阻力，促使黄酮类物质从植物中充分释放。王敏等[37]采用该法提取苦荞茎叶粉中总黄酮，实验表明：在相同温度、pH 值和处理时间下，经酶解工艺处理的苦荞茎叶样品总黄酮提取率是未经酶解样品的3.08 倍，且大大缩短了提取时间。Zuorro 等[38]以纤维素酶辅助乙醇提取玉米壳中类黄酮物质，在最佳条件下，提取率可达1.3%，该工艺使玉米壳得到了进一步的利用，同时也有利于环保。薛晶晶[39]优化了纤维素酶辅助乙醇回流提取芹菜总黄酮的工艺，最终芹菜总黄酮的提取率为4.17%，该法提取率高，操作方便，条件温和，有效地保证了有效成分的原生特征。

1.2.6 机械化学辅助提取

机械化学辅助提取（Mechanochemical-assisted Extraction,MCAE）将机械粉粹和固相化学反应相结合，通过机械粉粹破坏细胞壁，增加颗粒的表面积和裂缝，促进溶剂进入细胞将物质溶出，而固相化学助剂与有效成分发生反应以改变其溶解性，从而提高提取率[40]。Xie 等[41]利用机械化学辅助提取木槿中的芦丁，固体碱性试剂为15.0%（wt）Na2CO3和1.5%（wt）Na2B4O7‧10H2O 在AGO-2 型高强度行星磨上磨4 min，浸提温度25℃，H2O 为萃取溶剂，总浸提时间15 min（两次循环10 min 和5 min），酸化pH 值5.0，溶剂/物料比25 mL/g，得到芦丁的最高收率5.61 mg/g，提取率高达96.8%。Zhu 等[42]优化了机械化学辅助提取银杏叶黄酮的条件，结果显示，固体氧化物（NaHCO3）含量21%（wt），研磨时间7.5 min，溶剂固比33 mL/g，在此条件下，银杏叶黄酮的提取率为0.683%，另外，MCAE 法以水作为溶剂，对环境友好。

1.2.7 动态高压微流化辅助提取

动态高压微流化（Dynamic High-pressure Micro-fluidization-assisted,DHPM）辅助提取的原理是通过剪切、碰撞和空化作用对样品进行高强度处理，使材料粒径减小，分散均匀，加速有效成分在溶剂中的溶解速率，进而有效提高活性成分的提取效率[43]。Jing 等[44]研究了DHPM 技术对油莎草叶总黄酮提取的影响，并对其抗氧化活性和抗菌性能进行了评价。结果表明，DHPM 预处理不仅能有效地提高总黄酮的收率，而且能增强总黄酮的抗氧化活性。涂招秀等[45]研究了DHPM 对蔓三七叶中黄酮提取率的影响，结果表明，微射流均质压力对黄酮提取率有先增加后减小的趋势。郭改等[46]以总黄酮提取率为考察指标，通过单因素及正交试验得到了油莎草总黄酮的最优提取工艺，并采用紫外与红外光谱和高效液相色谱―质谱联用法（HPLC-MS）分析了DHPM 辅助提取对总黄酮结构和组成的影响。结果显示，DHPM 辅助提取总黄酮的提取率和抗氧化性均有积极作用，而且该技术并未改变总黄酮的组成，仅使有些组分的比例发生了变化。

1.2.8 加速溶剂提取

加速溶剂提取法（Accelerated Solvent Extraction,ASE）也称加压液体萃取法，是一种用液体溶剂萃取固体或半固体样品的技术，其提取原理是通过升高常规液体溶剂的温度和压力，以此改变提取体系的分配系数和动力学特征，从而显著提高提取效率。加速溶剂提取时间短，溶剂耗费少，无需过滤，较常压溶剂萃取有显著优势。Niu 等[47]优化了加速溶剂萃取技术提取海刀豆中总黄酮的提取工艺，得出最佳萃取条件：压力10.3 MPa，温度130℃，时间16 min，66%（V/V）甲醇，循环2 次，总黄酮提取率为83.43%，与理论值相对偏差－1.63%。Okiyama 等[48]利用加速溶剂提取可可豆壳中黄烷醇和生物碱，实验表明，随着时间和温度的增加，提取率先增加后慢慢趋于平衡，在温度90℃，时间50 min 时，黄酮提取率最高。

1.2.9 闪式提取

闪式提取器是根据组织破碎原理设计而成的一种新型提取器，通过机械剪切力和搅拌力以及高速旋转的刀刃使内外刀刃之间产生涡流负压，在室温及溶剂存在的条件下数秒内将植物组织破碎至细微颗粒，使有效成分与溶剂充分接触，并达到组织内外平衡，实现提取目的。陈卓君等[49]采用闪式提取法对玫瑰果肉中的黄酮类化合物进行提取，在最佳条件下，提取率为5.78%。王全泽[50]采用该装置提取罗汉松总黄酮，并考察了罗汉松总黄酮对DPPH 自由基、O2-自由基和OH 自由基清除能力，经单因素和响应面分析得到最佳工艺参数。结果表明，当乙醇浓度71%（V/V）、料液比36∶1（mL/g）、提取时间53 s、提取电压为75 V时，总黄酮提取率为8.147%，对DPPH 自由基、O2-自由基和OH 自由基清除能力明显，最大清除率分别达到87.13%、58.24%和67.56%。邱相坡[51]基于响应面法优化了连翘果实总黄酮的闪式提取工艺条件，最佳条件下总黄酮提取率可达18.256%，重复验证提取率均值为18.030%，说明该工艺参数稳定可靠，而时间仅需80 s。闪式提取法能最大限度地保障样品中有效成分不受热破坏，提取时间短、效率高、安全可靠、应用前景非常广泛。

1.3 耦合提取法

耦合提取是在单一提取和辅助提取技术基础之上多种技术串联或并行的一种强化提取工艺，耦合多种方法的优势，以达到节约时间成本、提高提取效率和产品纯度的目的。例如超临界耦合有机溶剂萃取法，前者的减压放气过程有气爆破壁作用，大大降低了有机溶剂提取时的传质阻力；此外，低极性挥发性组分的去除有利于乙醇水溶液与植物活性组分的后续渗透[52]。Xu 等[53]研究了酶法辅助超声-微波协同提取果皮中黄酮类化合物的方法，实验表明协同作用下提取率比任何单一技术（溶剂萃取法、超声辅助萃取法和微波辅助萃取法）的提取率都要高，与之相比，分别提高了26.50%、22.31%和12.98%。吴淑清等[54]以乙醇溶液为溶剂，采用复合酶（纤维素酶/果胶酶）协同超声波提取当归叶中总黄酮。结果发现，当复合酶比例为2∶1、料液比1∶30（g/mL）、乙醇浓度50%（V/V）、超声温度50℃时，总黄酮提取量达到最大值，为12.6 mg/g。耦合提取法将多种技术串联或并行，虽将各技术的优势集于一体，黄酮物质的提取率有较大的提升，提取周期也明显减短，但当前大多局限于实验室提取，从黄酮类化合物工业化提取的角度来讲，设备成本和能耗也将大大增加，难以实现效益最大化，因而该方法的应用具有一定的局限性。

2 提取技术优缺点对比

为了便于比较，对黄酮类化合物不同提取技术的优缺点汇总于表1、表2 和表3。

表1 单一提取技术优缺点

（续表1）

表2 辅助提取技术优缺点

表3 同一原料的不同提取技术比较

由表1 和表2 可知，单一提取技术操作简单易行，但普遍存在提取周期较长和提取率不高的问题。在单一方法的基础之上，借助一些特殊场效应强化传质过程，如蒸汽爆破、脉冲电场、超声波场、微波场等，因辅助手段的引入，黄酮物质的提取率和提取周期都有很大的改观，而且黄酮物质的原生特征也得到了很好的保留。耦合提取法虽然综合了各技术的优势，但成本和能耗较高，具有较多局限，故借助辅助手段以及对现行辅助技术的优化是当前提取黄酮物质的主要研究内容。由表3 可知，对于同一种原料，不同提取技术黄酮的得率有较大差异，实际过程中应综合考虑择优选择。

3 小结与展望

从天然植物中提取黄酮类化合物的方法较多，提取手段基本上从有机溶剂到绿色溶剂，从单一提取法到辅助提取进而到耦合提取，目前已是多种方法的串联或耦合应用于黄酮类化合物的提取，在产品纯度、提取效率和能耗等方面取得了重大进步。各种提取技术从成本、规模和效率上各自都有其优缺点，实际过程中应综合考虑各技术的利弊进行优选。另外，含有黄酮物质的天然植物比较多，目前大多学者研究了银杏叶、槐花、苦荞等植物中黄酮含量情况，诸如烟草等植物中黄酮物质含量也很丰富，但研究情况还很少见，这也是本课题组今后的研究重点。总的来说，提取技术虽多，但大多只能停留在实验室规模，实验室提取工艺与工业生产脱节比较严重，工业化生产和实验室研究密切接轨是今后研究的一个重点。

本文通过比较不同提取技术的优缺点，为实践中方法的选择提供了便利，也为今后的研究方向提供了思路：1）将实验室研究与工业化生产紧密联系起来，完善实验设备和提取工艺更好地为工业生产提供便利；2）根据不同方法的特点，可以将不同方法串联或耦合起来，综合考虑成本和效率的关系；3）优化样品的前处理技术；4）丰富提取黄酮物质的植物源。